CUANTIFICACIN DE ADN GENMICO POR NANODROP
Maura Fiallos
Laboratorio de Ingeniera Gentica, Facultad de Ciencia e Ingeniera en Alimentos,
Universidad Tcnica de Ambato
Resumen
En la prctica se cuantific por medio del Nanodrop la cantidad de ADN
genmico de levaduras presente en las muestras de extraccin obtenidas
mediante el mtodo de Hoffman. El equipo utilizado midi la concentracin
de ADN en ng/l con una relacin 260/280 de
entre 1.8 y 2.0 para
especificar la pureza de la muestra ya que los cido nucleico se leen a
260nm y las protenas a 280 nm. Los valores obtenidos oscilan entre 2042.3
y 3383.9 ng/l que es una concentracin de excelente calidad para que ese
ADN pueda ser utilizado en otros procedimientos de biologa molecular.
Introduccin
Ensayos biomoleculares se estn desarrollando continuamente que el uso
de cantidades cada vez ms pequeos de material, que a menudo impide el
uso
de
cubetas
convencionales
basados
en
instrumentos
para
la
cuantificacin de cidos nucleicos para aquellos que pueden realizar la
cuantificacin microvolumen. (Saltos, 2012)
Reducir el volumen de muestra necesario para el anlisis espectroscpico
tambin facilita la inclusin de nuevas medidas de control de calidad a lo
largo de muchos flujos de trabajo molecular, incrementando la eficiencia y
en ltima instancia conduce a una mayor confianza en los resultados
posteriores. (Sgiker, 2010)
El NanoDrop ND-2000 es un espectrofotmetro de espectro total (220750nm) que mide concentraciones con 1 l de muestra, con gran exactitud
y reproductibilidad. Utiliza una nueva tecnologa que usa la tensin
superficial para mantener la muestra en su sitio y se eliminan las cubetas
de mesura. Adems, el ND-2000 tiene la capacidad de medir muestras muy
concentradas, sin necesidad de diluirlas (acepta 50X ms de concentracin
que las medidas estndares con cubetas). Esta caracterstica lo hace idneo
para medir la concentracin de cidos nucleicos y para determinar su
cualidad. El software calcula automticamente la concentracin de los
cidos nucleicos siguiendo la relacin:
1 A260nm = 1 OD DNA = 50 g/ml
1 A260nm = 1 OD RNA = 40 g/ml (Desjardins, Conklin, 2010)
Debido a los anillos presentes en las bases nitrogenadas del ADN, esta
molcula tiene absorbancia mxima a 260 nm.
La prctica tiene como objetivo cuantificar el ADN presente en la muestras
de levaduras a travs del espectrofotmetro NANODROP. (Saltos, 2012)
Material y mtodos
Para
Nanodrop
ADN genmico
Agua ultrapura
la
prctica
se
utiliz
un
Thermocientific
Nanodrop
2000
(spectrophotometer-USA), para iniciar se descongelaron las muestras de
ADN genmico y se limpiaron
las superficies pticas superiores e
inferiores del sistema de espectrofotmetro colocando primero agua
destilada ultrapura invitrogen, se cerr el brazo de palanca, asegurndose
que el pedestal superior entre en contacto con el agua destilada. Se abri
el software NanoDrop y se seleccion la aplicacin de cidos nucleicos.
Con la pipeta calibrada en 1l se coloc agua para realizar una medicin
en blanco se baj el brazo de palanca y se seleccion "En blanco" en la
aplicacin de cido nucleico. Una vez hecha la medicin en blanco se
limpi las superficies pticas con un pao limpio, seco y sin pelusa y se
eligi la constante para la muestra que fue ADN 50. Se empez a
cuantificar colocando 1l en el equipo y midiendo la concentracin de
ADN con resultados inmediatos en el software.
Resultados
Figura#1: Equipo utilizado
Fuente: laboratorio de Ingeniera Gentica
Elaborado por: Maura Fiallos
Tabla#1
Resultados de concentracin y pureza
Cdigo
Conc. (ng/l)
260/280
260/280
CC038
2042.3
1.83
1.97
CC037
3383.9
1.89
1.49
2274
2499.9
2.01
1.89
CC039
3333.0
1.78
1. 66
Fuente: laboratorio de Ingeniera Gentica
Elaborado por: Maura Fiallos
La
concentracin
pureza
del
ADN
fue
obtenida
mediante
espectrofotometra, a una absorbancia de 260 nm donde se encontraron
valores altos de ADN como se observa en la tabla #1, lo que asegura una
extraccin adecuada del mismo, confirmando la efectividad del mtodo de
Hoffman ya que se dice que una buena concentracin de ADN para ensayos
moleculares como PCR oscilan entre los 2000 y 4000 ng/l en cuanto a la
pureza de la muestras se puede observar que los valores se encuentran
entre el 1.8 y el 2 que se exige para asegurar que lo que se est
cuantificando es ADN puro, sin presencia de ARN, protenas o carbohidratos,
a excepcin de la segunda relacin 260/280 en la muestras CC037 y CC039
que muestran contaminacin por protenas o carbohidratos pero la primera
relacin estn dentro del rango por lo que se generaliza diciendo que el ADN
obtenido es de buena calidad, alta concentracin y pureza.
Cuestionario
1. Indique otra manera de cuantificar la concentracin de ADN.
Electroforesis en gel de agarosa:
La calidad de las molculas extradas se analiza por electroforesis en
gel de agarosa. La agarosa es un polisacrido altamente purificado
derivado del agar. Se utiliza para separar macromolculas tales como
cidos nucleicos y grandes complejos proteicos. Tienen un menor
poder de resolucin que la poliacrilamida pero una gran rango de
separacin, tal que pueden ser separadas molculas de ADN desde
200
pb
hasta
aproximadamente
50.000
pb
(variando
las
concentraciones de agarosa). El tamao del poro del gel puede ser
predeterminado ajustando su concentracin en el gel; entonces a
mayor concentracin menor tamao de poro. El rango de trabajo es
aproximadamente entre 0,7% y 2% p/v. Con un gel 0,7% se obtiene
una buena separacin (resolucin) de grandes fragmentos de ADN (5
10kb) y con uno 2% se resuelven mejor los fragmentos pequeos
(0.21kb).
El ADN esta homogneamente cargada de forma negativa a pH
neutro, por lo que la relacin carga: masa es constante. Su velocidad
de migracin del ADN en la matriz de agarosa est determinada por
varios parmetros propios de la molcula. (Universidad Nacional de
Quilmes, 2010)
2. Qu indican los valores de pureza mayores y menores al
rango ptimo (1,8-2)?
Cualquier valor considerablemente por debajo de lo establecido es
indicio de contaminacin por protenas y/o carbohidratos mientras
que en el caso contrario valores mayores a 2 indican contaminacin
por ARN (Saltos, 2012)
3. Qu
indica
el
la
relacin
entre
la
absorbancia
260nm/230nm?
El valor de la lectura a 230nm (longitud de onda mnima) est
influenciado por la cantidad de sales presentes en la muestra en
relacin a los 260nm de absorbancia de los cido nucleicos. (Acosta,
2013)
Conclusin
Se realiz la cuantificacin del ADN en el Nanodrop donde se
obtuvieron valores altos de concentracin de ADN de entre un rango
de 2000 a 3400 ng/l lo cual da la idea de una correcta extraccin del
material gentico y eficaz para realizar otros procesos moleculares
como PCR. En cuanto a la pureza de las muestras se estableci
empleando los rangos 260/280 nm donde los valores de 1.8 a 2.0 son
considerados como ADN puro para el rango libre de protena,
carbohidratos o ARN. En las muestras obtenidas solo 2 mostraron en
la segunda relacin valores menores a 1.8 lo que dio la idea de una
ligera contaminacin por protenas o carbohidratos. En general la
cuantificacin se encuentra entre los rangos esperados concluyendo
que se obtuvo ADN genmico de alta calidad.
Bibliografa
Universidad Nacional de Quilmes, 2010. Introduccin a la Biologa Molecular
y Celular TP5: Extraccin de ADN disponible en:
https://ibcmunq.files.wordpress.com
Saltos N, 2012. Extraccin de ADN genmico y amplificacin de la regin
ITS por PCR en el ascomicete marino disponible en:
http://repositorio.ug.edu.ec
Acosta S, 2013. Biomasa: extraccion & cuantificacion de acidos
deoxyribonucleicos (adn) totales disponible en: http://www.uprm.edu
Sgiker, 2010. Universidad del Pas Vasco Purificacin y cuantificacin de
productos de PCR Disponible en: http://www.ehu.eus/documents
Desjardins P, Conklin D, 2010. NanoDrop microvolumen cuantificacin de
cidos nucleicos diponible en: http://www.jove.com/
