Química Biológica- UNNOBA- 2023

TP N°2: Cromatografía de Exclusión Molecular

La cromatografía de exclusión molecular es un método de purificación que mediante una
fase fija o matriz sólida de polímeros naturales y sintéticos separa moléculas en función de
sus tamaños moleculares y formas. La matriz sólida que se va a utilizar en el trabajo
práctico es Bio-Gel®P Polyacrylamide Gel.
Bio-Gel P son geles porosos formados por perlas de poliacrilamida, constituidos por
copolimerización de acrilamida y N, N'-metilen-bis-acrilamida. Los geles son
extremadamente hidrofílicos y, esencialmente, libres de carga, lo que les permite una
eficiente filtración. Su composición sintética y la ausencia de impurezas solubles impiden
la contaminación de las proteínas de la muestra. Bio-Gel P10 es inerte, por lo que no
existe interacción de tipo químico entre los componentes de la fase fija y las proteínas de
la muestra.
Las propiedades más importantes del Bio-Gel P10 son:
.- Tamaño de las partículas: 45-90 µm
.- Rango de fraccionamiento típico: 1500 a 20000 Da.
.- Resistencia:
pH 2-10
Presión 15 psi
Solventes orgánicos < 20%
Rango de Temperatura de Trabajo 4-80 °C
Autoclavable, a pH 5.5-6.5, a 120 °C por 30 min
.-La forma de gel se consigue por hidratación

Reactivos:
Bio-Gel P10
PBS Buffer 1X
Albumina sérica bovina (BSA) (PM: 67000 Da).
Factor de Crecimiento de Fibroblastos (FGF) (PM: 18000 Da).
Reactivo de Bradford.

Materiales e instrumental:
Columna cromatográfica
Pipetas
Tubos de ensayo
Papel de filtro

Procedimiento:
Preparación de la columna
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Se mezcla una cantidad adecuada de Bio-Gel P10 (2.7grs) con 40ml de un buffer fosfato
(PBS 1X) y se agita durante 3 hs para permitir la hidratación y formación del gel. Una vez
hidratado se procede a empaquetarlo dentro de la columna para lo cual se vierte el gel
poco a poco sobre las paredes de la misma, para evitar la formación de canales o grietas
que interfieran con la correcta filtración de la muestra. La altura de la columna preparada
debe ser de aproximadamente 10 cm. A continuación, se hace pasar suficiente cantidad
de fase móvil para lograr un buen empaquetamiento de la columna.
Es importante antes de verter el gel en la columna colocar 2 bolitas de vidrio para evitar
perderlo con la fase móvil.

Separación de FGF y BSA

* Como eluyente o fase móvil usar el buffer de fosfatos PBS 1X.
* Rotular los tubos de ensayo y colocarles 2 ml del reactivo de Bradford para recolectar las
diferentes fracciones.
* Equilibrar la columna con PBS.
* En un círculo de papel de filtro previamente colocado sobre el gel sembrar 40 µl de cada
muestra proteica, teniendo cuidado de no agitar el Bio-Gel P10.
* Abrir la llave de la columna permitiendo que la muestra penetre dentro de la resina
(tener cuidado de que no se deshidrate porque se quebraría).
* Agregar suficiente cantidad de buffer. Abrir la llave dejando que el líquido fluya fuera de
la columna. Las proteínas de la muestra se desplazarán lentamente a través de la
columna. Mantener siempre suficiente cantidad de buffer para impedir que se deshidrate
el biogel.
* Recoger fracciones de eluído de 1 ml cada una en los tubos que contienen Bradford
numerados previamente.
* Seguir recogiendo fracciones hasta que no haya variación de color en los tubos.
* Observar contra un fondo blanco todos los tubos y determinar la fracción de color más
intenso. Anotar a qué número de tubo corresponde.

Definiciones a tener en cuenta:

- El volumen de elución de una molécula en particular, es la cantidad de líquido (expresada
en ml) que debió atravesar la columna, en esas condiciones de corrida, para que la misma
se aisle en uno o más tubos; corresponde a un rango de volúmenes (por ejemplo, si hay
presencia de proteínas en los tubos 2, 3 y 4 el volumen de elución es de 1 a 4 ml, debido a
que se recogieron fracciones de 1 ml).
- La fracción de elución hace referencia al número del tubo (o números de los tubos) en
los cuales eluyó cada una de las proteínas. En nuestro ejemplo anterior, las fracciones de
elución son 2, 3 y 4.

Al escribir el informe no deben faltarles las respuestas a las siguientes preguntas o ítems:
- Concluir cuál es la utilidad de la columna cromatográfica.
- Determinar volumen de elución para las dos muestras y en qué fracción salió cada una
de ellas.
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- ¿Pueden determinar la identidad de cada proteína luego de la elución? De no ser así,

sugieran un método para determinar la identidad de las proteínas y cómo lo llevarían a
cabo.