PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE BIOLOGÍA (BI2201)

GRADO EN BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

PRÁCTICA 1:
Determinación de la concentración de prolina en un tejido vegetal.

Objetivos de la práctica

Los objetivos de esta práctica son:

• Determinar la concentración del aminoácido prolina en hojas de plantas de tomate,

Arabidopsis o cítricos en condiciones control y de sequía.
• Analizar la relación entre la concentración de prolina foliar y la respuesta de la planta
al estrés hídrico.
• Entender las funciones de la prolina en las plantas en situaciones de estrés hídrico.

1. INTRODUCCIÓN

Las plantas son organismos sésiles que viven en entornos medioambientales a menudo
subóptimos para su crecimiento y supervivencia. Uno de los factores climáticos que
perturban en gran medida a las plantas y a los cultivos es la falta de lluvia y la sequía
asociada a ella. La fotosíntesis, la fijación de nitrógeno y la disponibilidad de agua son
los principales determinantes de la producción vegetal, de manera que la sequía es de los
factores que más afectan negativamente a la producción de cultivos agrícolas.

Muchas plantas sometidas a estrés hídrico ponen en marcha cambios fisiológicos que
aumentan su tolerancia a dicho estrés. El ajuste osmótico aumenta la capacidad de
mantener la turgencia celular en situaciones de escasa disponibilidad de agua. Otro factor
que facilita la velocidad de respuesta de las plantas ante situaciones de estrés es la
capacidad de sus tejidos para modificar su metabolismo, es decir, reconfigurar la
producción de metabolitos tales como azúcares, aminoácidos y otros metabolitos
derivados. Entre ellos, destaca la acumulación del aminoácido prolina como respuesta al
estrés hídrico.

La prolina es un osmolito compatible, es decir, se puede acumular en el citosol sin

perjudicar al metabolismo celular, y ayuda directamente a mantener la turgencia celular

1
PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE BIOLOGÍA (BI2201)
GRADO EN BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

interna, lo que evita las pérdidas de electrolitos al mantener un buen equilibrio osmótico.
Además, el exceso de prolina estimula los cambios metabólicos en la planta para hacer
frente al estrés. La prolina también reduce las moléculas indeseables de oxígeno reactivo
(ROS) que, en momentos de estrés, pueden superar la capacidad natural de las plantas
para eliminar estas moléculas dañinas que normalmente se producen durante el
metabolismo.

Por tanto, la cantidad neta de prolina en las plantas en condiciones de estrés hídrico
aumenta por la inducción y/o activación de enzimas implicadas en su biosíntesis, así como
por la disminución de la actividad de enzimas implicadas en su catabolismo, permitiendo
a la planta adaptarse al estrés hídrico.

2. PROTOCOLO EXPERIMENTAL

1. Materiales
• Maza y mortero de porcelana • Tubos de centrífuga
• Tijeras • Pipetas Pasteur
• Pipetas automáticas • Espectrofotómetro
• Balanzas • Centrífuga
• Baño termostatado • Cubetas espectrofotométricas de plástico
• Probetas graduadas • Vórtex
• Tubos eppendorf de 1.5 mL
• Plantas de tomate control y estresadas por sequía

2. Reactivos

• Ácido acético glacial

• Ácido Ortofosfórico 6 M (100 mL): 69.2 mL de ácido Ortofosfórico 85% (p/v) y aforar
hasta 100 mL con agua destilada.
• Reactivo de Nihidrina (250 mL): 6,25 g de Nihidrina disuelto en 150 mL de ácido
acético glacial y 100 mL de ácido Ortofosfórico 6 M.
• Ácido sulfosalicílico 3% (200 mL): 6 g disueltos en 200 mL de agua destilada.
• L-Prolina 0.2 mM (50 mL): 1.15 mg L-Pro estándar disueltos en 50 mL de agua
destilada.

2
PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE BIOLOGÍA (BI2201)
GRADO EN BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

3. Procedimiento
1. Pesar 100-200 mg (según planta) de tejido de hojas o bien del grupo control o bien del
grupo de estrés hídrico y añadirlas al mortero.
2. Añadir 5 mL de ácido sulfosalicílico al 3% con una probeta graduada.
3. Con el mortero y la maza, se homogeniza el tejido con el ácido sulfosalicílico hasta
que quede una solución homogénea.
4. Pasar todo el contenido del mortero a un tubo de centrífuga.
5. Centrifugar a 4800 rpm durante 20 min.
6. Durante la centrifugación, preparar la curva de calibrado (un tubo por grupo):
Preparar los siguientes tubos eppendorf (un tubo por grupo):

Ácido sulfosalicílico [L-Pro]

Tubo L-Pro 0.2 mM
3% resultante
1 1000 μL 0 μL 0.2 mM
2 500 μL 500 μL 0.1 mM
3 350 μL 650 μL 0.07 mM
4 250 μL 750 μL 0.05 mM
5 50 μL 950 μL 0.01 mM
6 0 μL 1000 μL 0 mM

Preparar los siguientes tubos Falcon (un tubo por grupo), utilizando el tubo preparado en
la tabla anterior:

Tubo [L-Pro]
Tubo Ácido acético Ninhidrina
preparado
1 1000 μL 1000 μL 1000 μL
2 1000 μL 1000 μL 1000 μL
3 1000 μL 1000 μL 1000 μL
4 1000 μL 1000 μL 1000 μL
5 1000 μL 1000 μL 1000 μL
6* 1000 μL 1000 μL 1000 μL
*Blanco
7. Tras la centrifugación, en otro tubo Falcon, añadir 1 mL del sobrenadante procedente
de la muestra, 1 mL de reactivo de Nihidrina y 1 mL de ácido acético glacial.
8. Incubar todos los tubos en un baño a 100ºC durante 50 mins - 1h.
9. Tras la incubación, dejar enfriar la reacción en hielo durante al menos 5 min.
10. Pasar el contenido de cada tubo en cubetas espectofotométricas.
11. Medir en el espectofotómetro a 520 nm de longitud de onda, utilizando como blanco
el Tubo 6 preparado, los tubos procedentes de la recta de calibrado y del extracto de
muestra vegetal.
12. Anotar las Absorbancias obtenidas para cada tubo de la recta de calibrado:

3
PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE BIOLOGÍA (BI2201)
GRADO EN BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

Tubo [L-Pro] Absorbancia

1 0.2 mM
2 0.1 mM
3 0.07 mM
4 0.05 mM
5 0.01 mM
6 0 mM

13. Calcular la curva de calibrado y ([L-Pro]) vs x (Abs) en el Excel.

Anotar la ecuación de la curva de calibrado:

14. Anotar la Absorbancia obtenida de la muestra vegetal:

4
PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE BIOLOGÍA (BI2201)
GRADO EN BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

LAB QUESTIONNAIRE 1

Names:

1.- Calculate the concentration of proline (mmoles/g) in the leaves of the selected plants
following the following table:

Type of sample (control or drought-stressed):

Vol
Weight Abs [L-Pro] L-Pro
sulfosalicilic L-Pro (mmoles)
(g) 520 nm (mM) (mmol/g)
acid (L)
[L-Pro] (mM)* Vol L-Pro
Point 1 Point 14 Point 13 Point 2
sulfosalicílico (L) (mmoles)/Weight (g)
0.005

2.- Provide a reasoned explanation of the relationship between the amount of accumulated
proline in your tissue and the plant's hydration status.

3.- What roles does proline play in plants?