Universidad Veracruzana

Experiencia Educativa. –

Análisis Instrumental

Carrera. -

Químico Farmacéutico Biólogo

Semestre. –

Tercer semestre

Sección. –

Integrantes. -

 Reyes Vicente Diana Lisette

 Gil Lopez Desayly

 Reyes Castillo Kevin Roberto

 Gomez Bazan Darinel

 Hernandez Carrera Lizbeth

Fecha: 18/11/2021

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Práctica:
Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC): Análisis
Cuantitativo de Pigmentos Bioactivos.
Competencias específicas:
Realizar separaciones cromatográficas de compuestos bioactivos de interés
biotecnológico y alimentario.
Lugar de realización:
Laboratorio A3, Depart. Bioquímica y Biol. Molecular A. Facultad de Veterinaria

Profesor
- Dr. Fernando Gandía Herrero

Consideraciones generales:
- Los alumnos deberán acudir al laboratorio provistos de: bata, cuadernillo de prácticas,
rotulador de vidrio y calculadora.
- Este material se deposita en abierto al amparo de la convocatoria para promover proyectos
y acciones de innovación y mejora en la Universidad de Murcia para el curso 2017/2018 (R-
700/2017), con el proyecto “Proyección en abierto de actividades docentes con productos
cotidianos para el alumnado relacionados con la promoción de la salud”.

PRECAUCIONES

- El acetonitrilo y el metanol son dos disolventes orgánicos inflamables y tóxicos,

así que se evitará su contacto directo.
- En todo momento deberán seguirse las recomendaciones del manual de
“Seguridad en el Laboratorio” de la Universidad de Murcia, disponible en el área
de Recursos de la asignatura.

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1. INTRODUCCIÓN

Las técnicas cromatográficas se basan en la separación de moléculas por efecto de

su distribución entre una fase estacionaria (fija o confinada) y una fase móvil. Las
moléculas se separan por la distinta velocidad de desplazamiento en función de la afinidad
que tengan por la fase estacionaria y la fase móvil.

La Cromatografía Líquida de Alta Resolución (High Performance Liquid

Chromatography, HPLC) es la técnica analítica de separación más ampliamente utilizada,
siendo idónea para la separación de especies no volátiles (incluyendo de interés industrial
y farmacológico). Implica la utilización de un equipamiento específico y la separación se
produce trabajando con alta presión en columnas con matrices formadas por esferas de 3
- 10 μm de diámetro.
La cromatografía de reparto en fase reversa utilizando sistemas HPLC constituye
la técnica cromatográfica con mayores aplicaciones. En ella la fase estacionaria,
normalmente derivatizada con grupos C-8 ó C-18 es más hidrofóbica que la fase móvil.
La fase móvil suele ser agua con proporciones variables de disolventes orgánicos
miscibles, como acetonitrilo (MeCN) o metanol (MeOH). Esta técnica se aplica a gran
variedad de compuestos bioactivos de interés, incluyendo las betalaínas. Las betalaínas
son pigmentos vegetales característicos de plantas del orden de las Caryophyllales con
potente actividad antioxidante y capturadora de radicales libres. En animales se ha
demostrado la inhibición de la formación de tumores con concentraciones muy bajas de
los pigmentos en la dieta. La molécula más representativa de la familia de las betalaínas
es la betanina, de color violeta (λmax = 536 nm) y naturalmente presente en la raíz de la
remolacha roja, entre otras fuentes

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2. MATERIAL Y REACTIVOS

- Equipo de HPLC (bombas, inyector, horno, detector de absorbancia,…)

- Columna cromatográfica C-18 para HPLC (250 x 4.6 mm, partículas de 5 μm)
- Balanza
- Vasos de precipitados y tubos
- Viales de HPLC y filtros
- Centrífuga
- Pipetas Pasteur y varillas
- Pipetas y micropipetas

- Agua destilada
- Tampón de extracción de muestras (Fosfato 20 mM, pH 6.0, con ác. ascórbico 10 mM)
- Fase móvil A (Agua mQ + 0.05 % ác. trifluoroacético (TFA) filtrada)
- Fase móvil B (Acetonitrilo (MeCN) + 0.05 % ác. trifluoroacético (TFA))
- Muestras y patrones. Entre las muestras a analizar, trabajaremos con:

3. PROCEDIMIENTO
Basado en la publicación: “Determination of Beet Root Betanin in Dairy Products by
High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)”. Gandía-Herrero, F. et al. (2012).
Journal of Chemical Education, 89, 660-664. DOI: 10.1021/ed200397q
3.1. Preparación de las muestras.
En función del tipo de muestra:
- Patrón
A partir de un patrón de betanina de concentración 3 μM, preparar diluciones para
hacer una recta de calibrado con las concentraciones 0.6 μM (80 μL agua + 20 μL patrón),
1.2 μM (60 μL agua + 40 μL patrón), 1.8 μM (40 μL agua + 60 μL patrón), 2.4
(20 μL agua + 80 μL patrón) y 3 μM (100 μL patrón).

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- Muestras sólidas o semisólidas
En un vaso de precipitados, pesar una porción de muestra de aproximadamente 3
g. Añadir tampón de extracción a razón de 4 mL por cada gramo y agitar hasta tener una
mezcla homogénea.
- Muestras líquidas
Seguir los mismos pasos, pero sin añadir tampón de extracción.

TODAS LAS MUESTRAS: Transferir a un tubo de ensayo. Centrifugar a 16.000g

durante 20 min (IMPORTANTE: Equilibrar bien los tubos). Recoger el sobrenadante en
un vaso limpio.
Después:
IMPORTANTE: Filtrar TODAS las muestras a través de filtros de nylon de 0.45
μm de tamaño de poro.
3.2. Preparación del equipo de HPLC y equilibrado de la columna.
- Antes de usar el equipo, purgar las líneas que se van a utilizar con las fases móviles
correspondientes, cada una durante 10 minutos. Prestar atención a posibles
incompatibilidades entre los disolventes previos y los que se van a utilizar.
- Realizar lavado del inyector con MeOH 50% en agua.
- El lavado de los pistones se realiza con MeOH 50% en agua. Comprobar que hay
disolvente y que no hay burbujas en el tubo.
- Equilibrar la columna durante al menos 30 minutos con los disolventes a utilizar.

3.3. Introducir 150 μL de cada muestra en los viales de HPLC.

- IMPORTANTE: Tener precaución de que no quede ninguna burbuja en el vial.

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3.4. Programación de la elución e inyección de las muestras.
- Utilizar la siguiente elución en gradiente para el análisis (flujo de 1 mL/min).
tiempo % disolvente A % disolvente B
0 100 0
15 65 35
20 65 35

- Inyectar en el sistema 25 μL de cada muestra preparada.

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3.5. Obtención de los cromatogramas e integración de picos.
- Seguir la elución cromatográfica a la longitud de onda máxima del compuesto a
determinar, 536 nm.
- Comparar los cromatogramas obtenidos para las muestras con los del patrón.
- Determinar las áreas de pico para betanina en cada una de las muestras y en todas las
diluciones preparadas de los patrones.
3.6. Recta de calibrado.
- Utilizar las áreas de pico determinadas para los patrones de concentración conocida
para realizar una recta de calibrado, representando área de pico frente a concentración.
3.7. Análisis de resultados.
- Identificar los picos correspondientes a betanina en las muestras problema.
- Utilizar la recta de calibrado para determinar la concentración de betanina en las
muestras. Presentar los datos en mg/g. (El P.m. de betanina es 550 g/mol).

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4. RESULTADOS. Responde a las siguientes cuestiones.
- Representa la recta de calibrado para la determinación de betanina total, en el
ordenador (hoja Excel o similar) o en papel milimetrado.

- Determina la concentración de betacianina en cada una de las muestras preparadas.

Presentar los datos en μM y en mg/mL. (El P.m. de betanina es 550 g/mol).

- Si otro pigmento eluye con un tiempo de retención mayor que betacianina, ¿es más
hidrofóbico o más hidrofílico? Razona tu respuesta.

- Reflexiona acerca del uso de aditivos en alimentos y sobre las características ideales
de un colorante para uso alimentario.