Fundamentos y aplicaciones de la Biología Molecular y la Bioinformática

Laboratorio Práctico V: Purificacion de ADN Plasmidial

Resultados de Aprendizaje:
- Aplicar los fundamentos teóricos para la purificacion de ADN plasmial
desde bacterias competentes transformadas.
- Comparar dos metodologias para la extraccion de plasmidos a partir de
bacterias transformadas.

MATERIALES.

Crecimiento Bacteriano.

- Colonias bacterianas crecidas en placas Agar LB + Ampicilina (50 g/mL)

- Medio LB líquido + Ampicilina (50 g/mL).
- Rotador Termostatizado 37º C.
- Alcohol
- Pipetas Pasteur
- Micropipetas.
- Puntas.
- Stock Ampicilina (50 mg/mL).

Purificacion Plasmidial.

- Tubos con suspensión bacteriana medio (Medio LB liquido + Ampicilina (50

g/mL).
- Kit E.Z.N.A.® Plasmid Miniprep Kit.
- Solución GTE (Glucosa 50 mM + 25 mM Tris-Cl pH 8.0 + 10 mM EDTA pH 8.0) o
solucion 1 (E.Z.N.A. DNA Plasmid Mini Kit).
- Solución stock NaOH 10 N
- Solución stock SDS 10% o 20%
- Buffer Lisis Bacteriana (0,2 N NaOH + 1% SDS final ) o solucion 2 (E.Z.N.A.
DNA Plasmid Mini Kit).
- NaAc 3M pH 5.2 o solucion 3 (E.Z.N.A. DNA Plasmid Mini Kit).
- EtOH 100% frio
- EtOH 70% frio
- Agua Nanopure.
- Puntas con filtro p1000, puntas con filtro p200, puntas con filtro p10
- Micropipetas p1000, p200, p20, p10
- Tubos de 1,5 mL esteriles, Tubos 0,6 ml esteriles.
- NanoDrop 2000
- Microcentrifuga
- Vortex
- Bufer de carga para acidos nucleícos con gel red.
 - Gel Agarosa 1%
- Cámara electroforesis
- Fuente de poder

DESARROLLO DEL PRACTICO.

1.- Crecimiento Bacteriano.

La selección y posterior crecimiento de colonias transformadas se asegura tomando

una porción de una colonia (en verdad una unidad formadora de colonias o u.f.c), y
cultivándola en un medio nutritivo con condiciones de temperatura y oxigeno óptimas.
Una primera selección se hace al tomar solo colonias blancas desde la placa con X-gal
y ampicilina, las que teóricamente ingresaron el plásmido junto con un inserto que
interrumpe la síntesis de la enzima -galactosidasa. Junto con esto las colonias son
incubadas en presencia de antibiótico (en este caso ampicilina) que permite, por una
parte, una segunda selección de cepas que incorporaron el plásmido (que lleva la
información para la síntesis de -lactamasas que anulan el efecto del antibiótico), y
por otro lado someten a las bacterias a una presión selectiva que asegura que esta no
expulse el plásmido incorporado.

.- Seleccionar 2-3 colonias blancas de la placa del práctico IV: ligación y transformación
bacteriana.

.- Inocular de manera independiente las colonias en 5 ml de medio LB estéril. Adicionar

antibiótico seleccionador si es necesario.

.- Incubar por 12-16 horas a 37º C con agitacion suave (200 rpm).

2.- Extraccion de Plasmidos.

Minipreparación por Lísis alcalina.

Este método explota las diferencias en las propiedades de desnaturalización y

renaturalización entre el ADN plasmídial (ADN pequeños círculares), y el ADN
cromosómico (fragmentado). La alcalinización con NaOH en presencia de un
detergente aniónico (SDS) provoca la lisis celular, la desnaturalización del ADN
cromosómico y de las proteínas, y la liberación de los plásmidos. Los plásmidos se ven
menos afectados por su pequeño tamaño y estructura superenrollada. La
neutralización del medio en presencia de una concentración alta de sal (acetato
potásico), provoca la precipitación de las proteínas (por el tratamiento con el
detergente y la insolubilidad de la sal potásica del dodecil sulfato), y del ADN
cromosómico (por reasociaciones aleatorias intracatenarias). Los agregados insolubles
de proteínas y ADN cromosómico se separan por centrifugación del ADN plasmídico
que queda en el sobrenadante y conserva mayoritariamente su estructura nativa.
NOTA: Cada integrante realizara 1 Purificacion utilizando la metódica de lisis
alcalina normal y 1 purificación mediante utilizacion de un Kit de Purificacion para la
comparacion de resultados.

.- En 1 tubo de microcentrífuga (eppendorf) poner 1.5 ml del cultivo de sus colonias

seleccionadas en el paso anterior y dar un spin down x 20 seg. a máx. velocidad (10.000
rpm).

.- Eliminar TODO el sobrenadante dado que puede inhibir algunas enzimas (asegurarse de
eso haciendo spin down por 5 seg después de sacarles el sobrenadante inicial)

.- Resuspender el pellet en 100 l de solución GTE (Glucosa 50 mM + 25 mM Tris-Cl pH

8.0 + 10 mM EDTA pH 8.0) o solucion 1 del Kit de extracción. Dejar 5 min a tº ambiente.

.- Adicionar 200 l de Buffer de lisis bacteriana (0,2 N NaOH (4 uL Stock 10 N) + 1%

SDS final (20 uL stock 20% ), o solucion 2 del kit. Mezclar SUAVE, 4-6 veces y dejar en
hielo por 5 min.

.- Adicionar 150 l de NaAc 3M pH 5.2 o solución 3 del kit, mezclar (vortex por 2 seg), y
dejar en hielo por 5 min. (esta etapa es importante porque se forma una malla de ADN
cromosomal quedando ADN plasmidal libre)

.- Centrifugar a máx. veloc. por 5 min.

.- Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo (tratar de no llevar el pellet blanco), y

mezclar con 2-2.5 volumenes de etanol absoluto a -20ºC; vortex intenso x 5 seg. y dejar 10
min a -70ºC (o 30 min a -20 ºC). Aquí precipitaran los ác. nucleicos (ADN y ARN)

.- Centrifugar 20 min a 4ºC a 12.000 r.p.m.

.- Eliminar el sobrenadante (pellet transparente!!!), y adicionar al pellet 1 ml de EtOH 70%

(también debe estar a -20ºC), vortex x 5 seg. (lavado). Esto lo puedes hacer una o varias
veces dependiendo si desea eliminar el resto de sales que pudieron quedar. (Lo mínimo son
2 veces).

.- Centrifugar 10 min. (ojalá a 4ºC) a 12.000 r.p.m. (opcionalmente puede ser a temperatura
ambiente)

.- Eliminar el sobrenadante y dejar secando a temperatura ambiente por 10 minutos hasta

que el pellet este seco.

.- Resuspender el pellet en 20 - 30 l de buffer TE pH 8.0 o agua nanopure (se usan 2,5 - 5

l para análisis de restricción).
.- Medir concentración y pureza en equipo nanodrop 2000.

Purificacion utilizando Kit de Extraccion.

.- En 1 tubo de microcentrífuga (eppendorf) poner 1.5 ml del cultivo de sus colonias

seleccionadas en el paso anterior; spin down x 20 seg. a máx. velocidad (10.000 rpm).

.- Eliminar TODO el sobrenadante dado que puede inhibir algunas enzimas (asegurarse de
eso haciendo spin down por 5 seg después de sacarles el sobrenadante inicial)

.- Resuspender el pellet en 100 l de solución 1. Dejar 5 min a tº ambiente.

.- Adicionar 200 l de solucion 2, mezclar SUAVE (NO “VORTEXEAR”) 4-6 veces y

dejar en hielo por 5 min.

.- Adicionar 150 l de Solucion III e invertir hasta que se forme una malla blanca (ADN
cromosomal)

.- Centrifugar a máx. veloc. 12.000 rpm por 5 min.

.- Insertar la mini-columna Hi-bind en un tubo de colección.

.- Transferir el sobrenadante (sin tomar la malla blanca), a la mini columna e incubar

durante 1 minuto a temperatura ambiente.

.- Centrifugar la mini-columna junto con el tubo de colección a 12.000 rpm por un minuto.
Descartar el líquido (algunas personas lo guardan hasta cuantificar las muestras finales), y
reinsertar la mini-columna en el tubo de colección.

.- Adicionar 500 L de Solucion de lavado Buffer HB, y centrifugar a 12.000 rpm por un
minuto. Descartar el líquido y reinsertar la mini-columna en el tubo de colección.

.- Adicionar 750 L de Solucion de lavado Wash Buffer (chequear que se le ha adicionado

el Etanol), y centrifugar a 12.000 rpm por un minuto. Descartar el líquido y reinsertar la
mini-columna en el tubo de colección.

.- Por último, para secar la membrana centrifugar la minicolumna junto con el tubo de
colección a 12.000 rpm por 1 minuto, con la tapa abierta para permitir la evaporación total
del Etanol.

.- Cuidadosamente, transfiera la mini-columna a un tubo de 1,5 mL.

.- Adicionar 25 L de agua nanopure a la mini-columna. Incubar por 1 minuto a

temperatura ambiente y centrifugar a 12.000 rpm por 1 minuto.

.- Descartar la mini-columna y proceda a la cuantificación de su muestra.

3.- Cuantificacion de Plásmido Purificado.

.- Tomar 1 L de su muestra para cuantificacion en Nanodrop .

.- Determinar la absorbancia de su muestra a 260 nm y 280 nm
.- Determinar la concentracion y pureza de su muestra original purificada (Relación
260/280 nm) usando la siguiente relacion:

1 Unidad Absorbancia a 260 nm = 50 g/ mLde ADN

4.- Elaboracion del Informe.

La no entrega del informe en los plazos estipulados se considerara como no entregado

y calificados con la nota mínima.

.- Su informe debe incluir:

- Calculo de rendimiento y pureza del plasmido purificado.

- Conclusiones PERSONALES comparando ambos métodos de purificacion
utilizados
- Conclusiones particulares con respecto al analisis de su muestra y las conclusiones
comparandos con la purificacion de las otras muestras.

Cuestionario (no debe ir incluido en el informe).

.- Cual es el fundamento de las etapas de la purificacion de plasmidos mediante lisis

alcalina.
.- Que diferencias esperaria encontrar al comparar las purificaciones por lisis alcalina y
purificacion con kit.
.- Como puede chequear si realmente purifico un plasmido.