CROMATOGRAFIA DE TAMIZADO MOLECULAR /

FILTRACION EN GEL / EXCLUSION MOLECULAR

1.-FUNDAMENTOS DE LA CROMATOGRAFIA DE TAMIZADO MOLECULAR.
Las biomolculas presentan una serie de propiedades fsicas (tamao, forma y
carga, entre otras), qumicas (como la presencia de determinados grupos
funcionales) y biolgicas (como su capacidad de unirse especficamente a ligandos).
Estas propiedades se emplean habitualmente para aislar una molcula del resto de
las presentes en un extracto acelular. La cromatografa de tamizado molecular no
es destructiva y las muestras separadas pueden ser utilizadas para otro tipo de
cromatografa o anlisis. La cromatografa de tamizado molecular permite separar
molculas atendiendo a su tamao y, por consiguiente, a su peso molecular ver
esquema en Fig.1. Es aplicable fundamentalmente a molculas cuya forma
hidrodinmica se comporta como una esfera o elipsoide de revolucin (protenas
globulares por ejemplo). La fase estacionaria de la cromatografa est constituida
por geles insolubles en agua de naturaleza hidroflica que constituyen granos
huecos esfricos, de dimetro controlado y atravesados por numerosos poros de
dimetro homogneo: Las diferentes resinas utilizadas en este tipo de
cromatografa se diferencian por sus capacidades de resolucin (capacidad de
separar molculas de distinto tamao) que a su vez dependen tanto del dimetro
del grano del gel como del dimetro de los poros que presenta. Cuando se
cromatografa una muestra con molculas de diferente tamao, si se ha elegido
convenientemente la resina de filtracin, podrn existir molculas cuyo tamao les
impida penetrar por los poros del grano y, por tanto, solo podrn desplazarse por el
exterior de la resina. Por el contrario, las molculas cuyo tamao les permita
penetrar por los poros del gel, quedarn retenidas y retrasadas del frente, tanto
ms cuanto mas pequea es, ya que es mayor el camino que pueden recorrer.
Como consecuencia las molculas de mayor tamao saldrn primero de la columna,
mientras que las ltimas en salir sern las ms pequeas. Las diferentes resinas
comerciales, aparte de por sus capacidades de resolucin, se diferencian por su
naturaleza qumica. As, existen resinas de origen natural (de polisacridos o
dextranos), tales como Sephadex, de origen sinttico (geles de poliacrilamida),
tales como Biogel P, y de tipo mixto (dextranos entrecruzados con poliacrilamida),
como el Sephacryl.
En esta prctica utilizaremos Sephacryl S-200 como resina de filtracin
siendo su capacidad de resolucin entre 4 y 200 kDa de masa molecular.

Fig.-1 Esquema de la cromatografa en gel filtracin de molculas con

diferente tamao: Masa Molecular.

2.- OBJETIVO DE LA CROMATOGRAFIA EN GEL FILTRACION: MOLECULAS

QUE SE VAN UTILIZAN PARA CONSTRUIR LA RECTA PATRON.
DETERMINACION DE LA MASA MOLECULAR DE UNA PROTEINA.
- Objetivo de la prctica
El objetivo de la tcnica consiste en calibrar una columna de tamizado molecular,
mediante la elucin de una serie de protenas de masa molecular conocida
(patrones), obteniendo en primer lugar la absorbancia de las fracciones resueltas
frente a los mililitros de buffer de elucin de la columna. Esta informacin nos dar
el mximo de absorbancia y el Ve para cada protena. Se representa el volumen de
elucin, Ve, o el volumen de elucin relativo, Ve/Vo, de cada una de ellas con
respecto al logaritmo de su masa molecular respectiva. Se obtendr una recta Log
M versus Ve/Vo. Utilizando estos datos se calcular la masa de la protena
problema cuya masa molecular es desconocida y tiene un Ve de 35,8 ml. De este
modo tendremos una valoracin muy prxima a la masa real de la protena
problema purificada por esta tcnica y podremos estudiar posteriormente alguna de
sus caractersticas. Las macromolculas presentes en la mezcla son el polmero azul
dextrano de elevada masa molecular 2103 kDa de carcter no inico, Alcohol
deshidrogenasa (150kDa), Seroalbmina bovina (66 kDa), Citocromo c (12,4 kDa),
Aprotinina (6,5 kDa) y DNP-glicina (DNP-Gly) de 241 Da. Se determinar adems,
el espectro de absorcin del citocromo C purificado con el objetivo de determinar
los mximos de absorcin.
3.- MATERIALES Y METODOS UTILIZADOS EN LA REALIZACION DE LA
CROMATOGRAFIA:
3.1. Materiales y Equipamiento necesarios
- Mezcla de protenas de masa molecular conocida.
- Columnas de 30x1,5 cm, con llave de cierre, pi de columna y dos
pinzas, gel Sephacryl S-200.
- Tampones, HCl, NaCl, Tris.
- Sistema integrado de baja presin con bomba peristltica, Unidad
de deteccin UV 280nm de flujo contnuo, Colector de fracciones,
Registro
- Espectrofotmetro, gradillas, agitatubos, tubos, pipetas Pasteur
plstico, vasos de precipitados.
3.2. Objetivos concretos de la prctica de tamizado molecular.
- Cromatografa de filtracin en gel
- Localizacin de las macromolculas y clculo de masa
aproximada de una protena problema.
- Espectro de absorcin. Una vez separadas, se obtendr el
espectro de absorcin y se determinarn los mximos de absorcin
del Citocromo C en la columna de exclusin molecular.
4.- PROTOCOLOS EXPERIMENTALES UTILIZADOS EN EL DESARROLLO DE LA
PRACTICA.
4.1. Protenas patrn para la elaboracin de la recta patrn:
Alcohol deshidrogenasa (150kDa), Seroalbmina bovina (66 kDa),
Citocromo c (12,4 kDa), Aprotinina (6,5 kDa). Adems se utilizarn
como marcadores, azul dextrano de masa molecular 2103 kDa y DNPglicina (DNP-Gly) de 241 Da.

4.2.Tampones y concentracin de protenas y marcadores.

- Tampn de cromatografa: Se utiliza 10mM Tris-ClH pH=8, en presencia de
NaCl 150mM. Se puede disponer de una solucin 1 M de Tris-HCl con 15 M
de NaCl, a este buffer se le puede adicionar 0,01% p/v de NaN3.
- Mezcla de molculas a separar: Se disuelven en 20 ml y se alicuotan en
tubos Eppendorf volmenes de 0,7 ml. Y se guardan a -20C.
*5 mg de N-2,4-DNP-Glicina (241Da)
*20 mg de Aprotinina (6,5 kDa)
*20 mg de Citocromo c (12,4kDa)
*20mg de Seroalbmina bovina (66kDa)
*20mg de Alcohol deshidrogenasa (150 kDa)
*5mg de Azul dextrano (2000 kDa).
- Columna montada de reserva de Sephacryl S-200.
- Tubos, pipetas Pasteur de vidrio y plstico vasos de precipitados, tubos
espectrofotmetro.

4. 2. Mtodo experimental
4.2.1. Cromatografa de filtracin en gel
- La columna ha de estar montada y equilibrada antes de comenzar la
prctica. Durante el desarrollo de la cromatografa el gel ha de estar cubierto
con tampn en todo momento. Muy importante: Tener cuidado y evitar
que no se seque en ningn momento la columna en la parte superior,
por lo que debe estar al menos con 3 cm de tampn.
- Para aplicar la muestra con marcadores y protenas, cerrar la salida
eliminar el tampn sobrante en la parte superior del gel hasta que se
aprecie la superficie del gel, dejar fluir el tampn hacia abajo o bien
retirarlo, cuidadosamente con una pipeta Pasteur de vidrio y depositar
con cuidado sobre el gel 700 l de la mezcla de macromolculas a
separar. Dejar que la muestra se absorba en el nivel del gel abriendo de
nuevo el tapn de la columna y recogiendo a partir de este momento las
sucesivas fracciones de elucin. Conectar la bomba, el detector, registrador
y el colector de fracciones; aadir suavemente la muestra y vigilar que
continuamente le llega tampn desde el reservorio para tampn de
cromatografa.
- Dejar pasar aproximadamente el volumen necesario de tampn, hasta que
todas las molculas hayan salido de la columna y anotar este volumen, el
color del Citocromo c y
de DNP-Gly facilitarn el seguimiento de la
separacin y elucin en la columna.
- El volumen de salida de la columna o volumen de elucin (Ve) se recoger
en fracciones de 1 a 1.5 ml en tubos adecuados y se aadir posteriormente
algn ml de H2O si fuera necesario para realizar el espectro de absorcin del
Citocromo c usando como referencia el tampn de cromatografa, que se
mantendr siempre en un tubo o cubeta y la muestra en otro). El espectro
se representa una grfica con la absorbancia en ordenadas frente a la
longitud de onda en abscisas.
- Una vez recogida la DNP-Gly (color marillo) la columna se debe de limpiar
dejando pasar 150 ml ml de tampn y se guardar la columna a 4C hasta
su posterior utilizacin.
4.2.2. Localizacin de las macromolculas.
Habitualmente la presencia de protenas en las fracciones cromatogrficas se
determina midiendo la absorbancia a 280 nm (ultravioleta) u otra longitud

de onda para protenas coloreadas, o bien cuantificando su concentracin en

cada fraccin por un mtodo colorimtrico (por ejemplo, Bradford). El
grfico que representa la cantidad de protena frente al volumen de elucin
(o nmero de fraccin) se denomina cromatograma.

5.-OBTENCION Y PRESENTACION DE RESULTADOS DE LA CROMATOGRAFIA

EN GEL FILTRACION
5.1. Obtencin de Datos, y Presentacin: Tablas y Grficas
Representacin Tabla y Figuras del Cromatograma: Representacin
absorbancia frente a los mililitros de buffer eluido de la columna.
Teniendo en cuenta el cromatograma que representa la absorbancia de
distintas fracciones cromatograficas (ordenadas) frente a su volumen
elucin en ml, (abscisas), determinar en el mximo de absorbancia, el Vo
azul dextrano y el Ve para cada protena y clcular la relacin Ve/Vo.

MARCADOR/
PROTEINA

MASA
MOLECULAR

Azul Dextrano

2x106 Da

Alcohol DH
Seroalbmina b
Citocromo C
Aprotinina
DNP-Gly

Log M

Ve(ml),
Ve/Vo

de
las
de
del

Kav

150x103 Da
66x103 Da
12,4x103 Da
6,5x103 Da
241

Da

Se determinarn los valores de Ve, Ve/Vo, y el coeficiente de distribucin

Kav de cada protena. A continuacin se representarn en tres grficas de
forma semi-logartmica la masa molecular de cada molcula (en
ordenadas) frente a Ve, frente a Ve/Vo y frente a Kav (en abscisas), ajustar
la recta e interpolar el Ve = 35,8 ml de la protena problema y deducir su
masa molecular.

Ve-Vo
Kav =

--------------Vt- Vo

Por ltimo determinar el espectro de absorcin del Azul dextrano, Citocromo

C y DNP-Gly y comparar los mximos de absorcin.

6.- CUESTIONES
3.1. Explicar cada una de las propuestas planteadas.
- 1 Porque se realizan los espectros de Absorcin. Cul es el mximo de
absorcin de cada molcula y del citocromo C? A qu grupos
funcionales se debe dicha absorcin? Otras protenas conocidas que con
este grupo funcional presentarn esta misma caracterstica?
- 2 Explicar: a) Cromatograma obtenido. b) La representacin Log M
versus Ve/Vo.
- 3 Porqu se calcula Kav, y qu significa?. Porque se representa Log M
versus Kav?, qu aporta esta representacin a los objetivos planteados?
- 4 Crees que el mtodo utilizado es el nico para separar estas molculas?
Por qu?. Sera conveniente realizar otro tipo de cromatografa adicional
para la determinacin precisa de la masa molecular de la protena y su
pureza?. En caso afirmativo, que clase de cromatografa propones y que
tipo de tcnicas aplicaras para determinar la calidad de la purificacin.
- 5 Representa un esquema lo mas detallado posible del equipamiento
utilizado (cromatgrafo de protenas de baja presin), explicando la
funcin y utilidad prctica de cada componente del equipo, indica en un
esquema las uniones mediante tubos de silicona entre los componentes
del sistema y razona porqu se han realizado de ese modo. Podra
haberse planteado otro tipo de uniones entre los componentes del
sistema?