BRADFORD

Breve descripción del método

El método, descrito por primera vez por el Dr.. Marion Bradford en 1976, se basa en una
reacción colorimétrica de proteínas con un tinte, Coomassie Azul Brillante G-250. Las
proteínas se unen al tinte en un ambiente ácido., induciendo un cambio espectral del color
marrón (absorbancia máxima a 465 Nuevo Méjico) al azul (absorbancia máxima a 610
Nuevo Méjico). Las interacciones hidrófobas e iónicas con las proteínas de la muestra
estabilizan la forma aniónica del tinte., provocando un cambio de color visible.
El color azul que se desarrolla es, por tanto, proporcional al contenido de proteínas y se
puede medir espectrofotométricamente en 595 Nuevo Méjico, una longitud de onda donde
la diferencia de absorbancia entre las dos formas coloreadas del tinte es mayor.
Algunos consejos antes de empezar
El ensayo se realiza a temperatura ambiente..
El método de Bradford para el ensayo de proteínas es compatible con la mayoría de las
sales, solventes, amortiguadores, tioles, sustancias reductoras, y agentes quelantes de
metales en muestras de proteínas, pero no con detergentes [Stoscheck, C. METRO.
(1990 -1) ]
La presencia de detergenos (es decir 0.1% SDS – pero no 0.02% SDS – y 0.5% Tryton –
pero no 0.1% Tryton) a concentraciones que normalmente se utilizan para solubilizar las
membranas celulares provoca la precipitación del tinte, por lo tanto interfiriendo con las
mediciones.

Si hay detergentes en su muestra, usted puede 1. eliminar el detergente por ej.. filtración
en gel o diálisis, 2. Incluya los detergentes en el blanco de reactivo y los estándares de
calibración exactamente a la misma concentración que en la muestra. 3. elige otro método

La presencia de una base en el ensayo da como resultado un aumento de la absorbancia

al cambiar el equilibrio del tinte libre hacia la forma aniónica.. Esto puede causar
problemas si la prueba se realiza en muestras disueltas en un tampón con una
concentración básica alta. [Stoscheck, C. METRO. (1990 -1)]
La presencia de glicerol., ácido ascórbico, clorhidrato de guanidina, 10 EDTA mM o
solución salina de alta concentración (4M NaCl puede interferir con el ensayo [Stoscheck,
C. METRO. (1990 -1)]
Si todas las sustancias enumeradas están presentes en la solución de proteína
desconocida, Es importante evaluar sus efectos sobre la absorbancia creando curvas
estándar tanto en presencia como en ausencia de este compuesto..
Si se observa una fuerte interferencia, Se puede realizar la precipitación de proteínas con
ácido desoxicolato / trecloroacético para eliminar el compuesto interferente y recuperar las
proteínas citosólicas y mebranas.

Aminoácidos libres, Los péptidos y las proteínas de bajo peso molecular no producen
color con los reactivos colorantes de Coomassie.. Por lo tanto, estas moléculas no
interfieren con la lectura espectrofotométrica y el ensayo de proteínas.. Como una regla
de oro, la masa de un péptido o proteína debe ser al menos 3,000 Da para cuantificación
con este reactivo.
Método Bradford: Protocolo
Equipo
Para realizar la prueba, necesitará pipeta y epps, un espectrofotómetro de luz visible y
poliestireno (barato) cubetas.

El colorante coomassie deja una pátina azulada en la cubeta que es prácticamente

imposible de quitar.. Para esto, es mejor usar cubetas de polisitreno desechables

Reactivos
REACTIVO DE BRADFORD:
Disolver 100 mg Coomassie Azul brillante G-250 en 50 ml 95% etanol (El etanol se puede
reemplazar con metanol – la misma cantidad – que es más barato pero definitivamente
más tóxico que el etanol!!)
agregar 100 ml 85% (Virginia Occidental) ácido fosfórico
Cuando el Coomasie se haya disuelto por completo, agregarlo a 500 ml de agua
(Precaución: Siempre agregue ácido lentamente al agua y no agregue agua al ácido).
Lleva el volumen a 1 litro, agregando agua adicional
filtrar a través de Whatman Grade 1 Papel de filtro cualitativo (11 retención de partículas
µm)
mantener en una botella de color ámbar a temperatura ambiente. Es estable durante
varias semanas.. Si observa la formación de precipitados con el tiempo, será necesario
volver a filtrar la solución
El reactivo de Bradford debe ser de color marrón claro.. Es posible que deba repetirse la
filtración para eliminar los componentes azules del reactivo..

El reactivo de Bradford es estable durante varias semanas.

El concentrado de Bio-Rad es caro, pero el fabricante examinó los lotes de tinte para
obtener la máxima eficacia. “hecho en casa” El reactivo funciona bastante bien, pero
generalmente no es tan sensible como el producto Bio-Rad..
ESTÁNDAR DE PROTEÍNA
Los estándares más utilizados para el ensayo de Bradford son la albúmina de suero
bovino. (BSA) y γ-globulina bovina (BGG) solución. También se puede utilizar
ovoalbúmina..
BSA 1 mg / ml
Para preparar un 1 mg / ml de solución de BSA, pesar 10 mg BSA y disolver en 10 ml de
destilado H2O.
Para evitar grumos, disolver colocando el polvo en la superficie del líquido. Como la
solución de BSA tiende a ser espumosa si se agita fuertemente, Mueva suavemente el
tubo tapado hasta que el BSA se haya disuelto por completo o revuelva suavemente con
un ancla magnética en un agitador. Almacenar en alícuotas disponibles a -20 ° C.

La absorbancia en 280 nm de esta solución en una cubeta de cuarzo de 1 cm de longitud

de trayectoria debe ser 0,66.

Curva de calibración

 Encienda el espectrofotómetro
 Lugar 1, 5, 10, 15, 20 y 30 µl (en duplicado) de un 1 mg / ml de solución de BSA (u
otra proteína utilizada como estándar – ver nota 1 debajo) en doce tubos de
microcentrífuga, y diluir a 100 µl con agua destilada (o el tampón de solubilización
de proteínas). De esta manera pones 1, 5, 10, 15, 20 y 30 µg de proteína BSA en
la muestra.
 En otros dos microtubos, lugar 100 µl de cada uno de agua destilada (o el tampón
de solubilización de proteínas) usado como blanco.
 Agregar 1 mL de solución de reactivo Bradford y mezcle bien invirtiendo los
tubos. Mezclar suavemente para evitar la formación de espuma, lo que reducirá la
reproducibilidad.


 Deje reposar los tubos durante al menos 2 minutos a temperatura ambiente y
hasta una hora
 Mida la absorbancia en 595 nm usando una microcubeta (1 ml)
  Cree una curva estándar trazando la absorbancia en 595 nm contra el contenido
de proteínas (en µg).

como una referencia, considere que la absorbancia en 595 nm de una muestra que
contiene 10 γg γ-globulina (o ovoalbúmina) es aproximadamente 0.45, el de una muestra
que contiene 10 ug de BSA es aproximadamente 0.8. Recuerde que la absorbancia
precisa varía según la edad del reactivo de Bradford utilizado en la prueba.. como
consecuencia, Es esencial construir una curva de calibración para cada conjunto de
ensayos..

Nota 1

Idealmente, la proteína utilizada para construir la curva de calibración debería ser la

misma proteína analizada, porque la capacidad de interactuar con el tinte, y por tanto el
desarrollo del color azul, varía con la variación de la proteína(s).

Dado que en el caso de la proteína celular el uso de las mismas proteínas para construir
la curva de calibración es imposible, se utilizan los estándares de proteínas enumerados
anteriormente.

La proteína más utilizada para construir la curva de calibración estándar es la albúmina

de suero bovino., ya que es económico y de fácil acceso. Muchos investigadores
realizaron sus estudios utilizando esta proteína como estándar.. sin emabargo, BSA,
Comparado a otro “promedio” proteinas, muestra una afinidad mucho mayor por el tinte,
con mayor desarrollo de color azul con la misma concentración de proteína. Utilizando
BSA como estándar, corre el riesgo de subestimar la concentración de proteína de la
muestra.

Por esta razón, La gammaglobulina sería la proteína estándar más adecuada..

Dada esta variación, Siempre es bueno especificar con qué proteína estándar se

construyó la línea de calibración para la dosificación con el método de Bradford.

Ensayo

 Pipetee muestras duplicadas que contengan 1-20 µg en un volumen total de 100 µl

en 1.5 Tubos de microcentrífuga de polietileno de mL. Si no conoce la
concentración aproximada de la muestra, analizar un rango de dilución (1, 1/10,
1/100, 1/1000) como en la siguiente tabla para tener una muestra con una
absorbancia que se encuentre dentro del rango de la calibración de la curva.

Recuerda multiplicar el contenido de proteína obtenido por el factor de dilución. (es decir.
1, 10, 100, 1000) al final del análisis para determinar el contenido real de proteína.

 Agregar 1 ml de reactivo colorante

  Deje reposar los tubos durante al menos 2 minutos a temperatura ambiente y
hasta una hora
 Mida la absorbancia en 595 nm y calcule el contenido de proteína consultando la
línea de calibración construida anteriormente..

Recuerde que la prueba debe permanecer lineal y seguir la ley de Lambert Beer ! Si la
absorbancia es mayor que 1.3 unidades de absorbancia (PARA), diluir más la muestra(s)
(tomando nota de la dilución para volver al contenido de proteína inicial) y repita la
medida!

Análisis

Prepare una curva estándar de absorbancia frente a microgramos de proteína y determine

las cantidades a partir de la curva.. Determine las concentraciones de las muestras
originales a partir de la cantidad de proteína, volumen / muestra, y factor de dilución, Si
alguna.
Recuerda multiplicar el contenido de proteína obtenido por el factor de dilución. (es decir.
1, 10, 100, 1000) al final del análisis para determinar el contenido real de proteína.

Comentarios

El reactivo colorante utilizado en el método Bradford reacciona principalmente con

residuos de arginina y menos con histidina., lisina, tirosina, triptófano, y residuos de
fenilalanina. Obviamente, el ensayo es menos preciso para proteínas básicas o ácidas.
El método Bradford está sujeto, como se mencionó, a variaciones en la sensibilidad entre
las proteínas individuales. Esta variabilidad se puede reducir realizando cambios en el
método. [Reade y col., 1981; Stoscheck, 1990-1]. Estos cambios requieren aumentar el
contenido de tinte o el pH de la solución.. En el método propuesto por Stoscheck (1990-1)
por ejemplo, el aumento del pH mediante la adición de NaOH al reactivo permite la
solubilización de las proteínas de la membrana mejora la sensibilidad del ensayo y reduce
en gran medida la variación observada con diferentes proteínas. sin emabargo, el ensayo
modificado es mucho más sensible a la interferencia de los detergentes en la muestra.
Para la medición de rutina del contenido de proteínas de muchas muestras, el método
Bradford puede adaptarse para su uso con un lector de microplacas. [Redinbaugh y col.,
1985]. En este caso el autor redujo a 0.2 ml el volumen total del ensayo, con el uso de
volúmenes iguales de muestra y reactivo colorante diluido. La ventaja es ahorrar tanto la
muestra como el tinte., hacer la prueba más rápida con el uso de un lector de microplacas