PRÁCTICA 5

Fagocitosis – Ensayo de Opsonocitofagocitosis

1. Objetivo

Valorar los fundamentos que sustentan los diferentes procesos involucrados en la respuesta
inmune innata y adaptativa a nivel celular y molecular, articulados con la práctica en el
laboratorio y como elementos esenciales de apoyo para otras áreas del ejercicio profesional.

2. Resultados de aprendizaje esperados

Identificar y describir los órganos, células y moléculas involucradas en los procesos de

presentación de antígenos y maduración de linfocitos.

3. Fundamento teórico

Los PMN (polimorfonucleares) son células especializadas en activar el mecanismo de la

fagocitosis, el mismo permite destruir a microorganismos a través del reconocimiento de ciertos
marcadores de superficie (CD´s), ya sean mediante la opsonización o mediante el
reconocimiento del marcador Scavenger.

Los receptores depuradores (scavenger receptors) representan aún una clase de receptores
fagocíticas que reconocen una diversidad de polímeros aniónicos y proteínas acetiladas de baja
densidad. (Roitt, 2015)

Los patrones moleculares asociados a patógenos (del inglés, Pathogen-associated molecular

patterns) representa el inicio del proceso de la fagocitosis. De esta manera, se da un proceso de
invaginación del agente externo, formando un fagosoma. Al interior de la célula, la unión de este
orgánulo con los lisosomas constituye un fagolisosoma, el mismo que generará enzimas
proteolíticas y cambios del pH para buscar la destrucción de la partícula al interior del
fagolisosoma. (Seegmiller, 2014)

Las actividades antimicrobianas en la fagocitosis se pueden clasificar en:

• Mecanismos dependientes de oxígeno:

o Intermediarios reactivos de oxígeno (ROI) o
Intermediarios reactivos de nitrógeno (RNI)
• Mecanismos independientes de oxígeno: proteínas antimicrobianas preformadas:
 o Péptidos catiónicos como las defensinas o
Catepsina G (proteínas neutra) o Lisozima
o Lactoferrina (secuestra Fe2+) (Valera, 2017)

La incubación “in vitro” de células fagocíticas con bacterias de características establecidas, como
una ATCC (del inglés, american testing culture collection) permitirá valorar la actividad cualitativa
de estas células, por lo tanto, en muestras sanguíneas con células viables se buscará eliminar a
las bacterias a través del mecanismo de la fagocitosis.

Como actividad complementaria, la opsonización ayuda a que el proceso de fagocitosis puede

darse de manera más efectiva, por lo tanto, la presencia de las proteínas del complemento debe
ser considerada en la muestra o a su vez, se debe enriquecer la muestra con suero fresco para
garantizar el proceso de opsonización.

4. Actividades prácticas

4.1 Preparación de la muestra de células

A partir de sangre periférica, se pretende cosechar células con actividad fagocítica

(polimorfonucleares) o monocitos.

4.1.1 Reactivos, materiales y equipos

REACTIVOS MATERIALES EQUIPOS
Solución Salina 0,85% Agujas toma múltiple calibre 21Gx1 ------
Torniquete hipo alergénico
Torundas con alcohol antiséptico
Tubos de extracción de sangre con
anticoagulante Heparina de sodio x 4 ml
Guantes descartables
Tabla 11 Materiales para obtención sangre heparinizada

4.1.2 Procedimiento

• Siguiendo los lineamientos de la guía GP-41A6 del CLSI (del inglés, Clinical & Laboratory
Standards Institute) se procederá a la extracción de sangre venosa de cada estudiante para
su respectivo procesamiento. (Clinical and Laboratory Standards Institute, 2017)
• Se obtendrán 4.0 ml de sangre total a cada estudiante
• Las muestras de sangre deberán permanecer a temperatura ambiente antes de su análisis.

4.2 Preparación de suspensión bacteriana

Para saber si los polimorfonucleares presentan una acción adecuada, se los debe enfrentar con
una cepa de bacterias a una concentración establecida a temperatura corporal por un lapso de
tiempo estándar.

4.2.1 Reactivos, materiales y

equipos
REACTIVOS MATERIALES EQUIPOS
Solución Salina 0,85% Cepa de ATCC Staphylococcus aureus 25904 Incubadora
Tubos estériles 12 x 75 mm Turbidímetro
Guantes desechables
Pipetas Pasteur de 3 ml
Tubos nuevos estériles 12 x 75 mm
Tabla 12 Preparación de la suspensión bacteriana para fagocitosis

4.2.2 Procedimiento

• Con el debido uso del equipo de protección personal, tomar el vial que contiene la
suspensión de cepas de Staphylococcus aureus 25904 y preparar una suspensión
equivalente al tubo No.3 de la escala Mac Farland (9 x 10 9 bacterias/ml) con un volumen
final de 3,50 o 4,0 ml.
• Preparar 3 tubos con un volumen de 1,0 ml de esta suspensión, rotular con los números #1
(15), #2 (30) y #3(60).
• Desactivar las cepas a usarse por el lapso de 30 minutos a 37 grados centígrados.
• Finalizado el tiempo de desactivación, dejar reposar por 5 minutos antes de empezar el
ensayo fagocítico.

4.2.3 Ensayo Fagocítico

Con el uso de la temperatura y lapsos de tiempos establecidos, se tratará de visualizar las

bacterias fagocitadas por los polimorfonucleares a través de la coloración Wright. (Valera, 2017)

4.2.4 Reactivos, materiales y

equipos
REACTIVOS MATERIALES EQUIPOS
Coloración Wright Cepa de ATCC Staphylococcus aureus 25904 Incubadora
Tubos estériles 12 x 75 mm Microscopio óptico
Pipetas Pasteur Termo bloque
Puntas amarillas
Puntas azules
Guantes desechables
Placas porta objetos
Tabla 13 Ensayo Fagocítico

4.2.5 Procedimiento

• Homogenizar la muestra de sangre obtenida 10 veces por inversión.

• Colocar 1 ml de sangre a cada tubo de la suspensión rotulada con números #1 (15), #2 (30)
y #3(60)#1, #2 y # 3.
• Agitar suavemente la suspensión formada para garantizar la homogenización de la muestra.
• Incubara 37 grados centígrados los tres tubos. Los intervalos de tiempo son 15 minutos, 30
minutos y 60 minutos.
• Al finalizar cada tiempo, sacar el tubo correspondiente de la incubadora.
• Con el tubo que finalizó la incubación realizar un frotis sanguíneo. Se puede realizar 2 placas
por tubo para mejorar los campos ópticos.
• Al final, se deberá tener 3 frotis sanguíneos, 1 placa por cada intervalo de incubación.
• Proceder a colorear las placas con la Coloración de Wright
• Observar con microscopia óptica y verificar la presencia de bacterias dentro de los
polimorfonucleares.
• Anotar los resultados.

5. Cálculos y/o resultados

5.1.1 Escala Mac Farlanda

5.1.2 Intervalo de referencia

Después de la visualización de 100 células con aumento de 100x, se pueden tener los siguientes
resultados:

VALORES INTERVALO DE REFERENCIA

0 – 1 bacterias/célula Fagocitosis negativa

1 – 20 bacterias/célula Fagocitosis incipiente
20 – 40 bacterias/célula Fagocitosis moderada
Más de 40 bacterias/célula Fagocitosis excelente

Tabla 14 Intervalos de referencia para ensayo Fagocítico

6. Presentación de resultados (Informe o reporte)

Para la elaboración del informe de resultados, se deberá tomar en cuenta el formato adjunto en
la sección de anexos. Para llenar la información del encabezado, se deberá colocar el nombre
del paciente que dio su sangre para la práctica.
7. Guía para discusión de resultados-cuestionario

Para reforzar los conocimientos adquiridos durante la práctica No. 1, se requiere que el alumno
conteste las siguientes preguntas y realice la discusión de las situaciones planteadas a
continuación:

Favor, resolver las siguientes preguntas:

8. Bibliografía