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1. ALCANCE
Este procedimiento describe los pasos para la determinación y cuantificación de Aflatoxinas
B1,B2,G1,G2 en granos enteros, nueces, suplementos y alimentos terminados para valoración por
medio de cromatografía de alta eficiencia (HPLC).
MATERIALES
3 PROCEDIMIENTO
3.6.4
3.6.5 Transferir 2ml de filtrado y 14 ml de buffer fosfato salino (PBS) a una jeringa plástica adaptada
a la columna de inmunoafinidad (ver figura 1)La mezcla se hacer pasar a través de la columna
de inmunoafinidad a un flujo de 2ml/min (también es posible dejar que la mezcla pase a
través de la columna por efecto de la gravedad). Un flujo lento y estable es esencial para que
las aflatoxinas sean retenidas por los anticuerpos contenidos en la columna.
3.6.6 Lavar la columna de inmunoafinidad pasando 20 ml de buffer fosfato salino (PBS) a un flujo de
5 ml/min. Pasar aire a través de la columna para retirar los restos de solvente.
3.6.7 Para eluir las aflatoxinas se hace pasar por la columna de inmunoafinidad 1.5 ml de Metanol al
100% a un flujo de una gota por segundo, y se recoge en un tubo de ensayo.
3.6.8 Una vez se ha recogido la totalidad del metanol en el tubo, poner la tapa inferior a la columna
y verter el contenido del tubo de nuevo en la columna. Retirar la tapa y recoger el metanol en
el mismo tubo. Este procedimiento se realiza dos veces mas para asegurar la liberación
completa de las toxinas en el metanol.
3.6.9 Pasar 1.5 ml de agua desmineralizada a través de la columna y recogerlos en el mismo tubo,
para completar 3ml de extracto.
3.7 DERIVATIZACIÓN
3.7.1 Para la derivatización, agregar 300 µL de la solución del estándar o muestra y 700 µL de
solución derivatizante en un vial, tapar el vial y agitarlo en vortex.
PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTÁNDAR
DETERMINACIÓN DE AFLATOXINAS B1,B2,G1,G2 POR HPLC
3.7.2 Calentar el vial en baño termostatado por 9 minutos a una temperatura de 65°C.
3.7.3 Dejar enfriar hasta temperatura ambiente.
3.7.4 Inyectar en el cromatógrafo.
Se deben tener mínimo dos inyecciones de estándar y dos inyecciones de muestra. Se calcula el
promedio de estas dos inyecciones, para calcular el contenido de cada alfatoxina se usa la siguiente
ecuación.
Donde
A muestra: área promedio de la muestra
A std: área promedio del estándar
C std: concentración en mg/L del estándar
W muestra: peso inicial de la muestra
Fdm= factor de dilución de la muestra (nota: este factor corresponde al volumen de elución de la
columna (3mL) dividido la alícuota de muestra pasada por la columna (2mL))
Fdstd = Factor de dilución del estándar (corresponde a todas las diluciones realizadas al estándar
para la cuantificación)
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