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PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTÁNDAR

DETERMINACIÓN DE AFLATOXINAS B1,B2,G1,G2 POR HPLC

Código: POE-HPLC-XX Versión: 01 Página 1 de 5 Fecha:

1. ALCANCE
Este procedimiento describe los pasos para la determinación y cuantificación de Aflatoxinas
B1,B2,G1,G2 en granos enteros, nueces, suplementos y alimentos terminados para valoración por
medio de cromatografía de alta eficiencia (HPLC).

2. PRINCIPIO DEL MÉTODO

El método se basa en la extracción de las aflatoxinas presentes en una muestra y su posterior


retención en una columna de inmunoafinidad, para ser eluídas y analizadas por medio de
cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC).

MATERIALES

REACTIVOS EQUIPOS Y MATERIAL


Ácido Acético Glacial Viales de cromatografía
Ácido Trifluoroacético R.A. Jeringa plástica 20 ml
Buffer Fosfato Salino (PBS) Pipeta aforada de 2 ml y 5ml
Metanol 100% Licuadora
Agua desmineralizada. Papel Filtro de filtración intermedia
Estandar Aflatoxinas (5.0 µg/mL de Columna de inmunoafinidad Easi-extract Aflatoxin®
Aflatoxinas totales)
Acetonitrilo R.A. Embudo para filtración
Cloruro de Sodio R.A. Probeta de 100ml
Beaker de 150ml
Tubo de vidrio 13*130mm con tapa
Transferpipetas de 20-200µL, 100-1000µL y 0,5-5mL
Tubos de ensayo de vidrio 13*185mm
Tubos de centrifuga plásticos con tapa
Baño termostatado (temperatura=65°C)
Cromatógrafo líquido HPLC con detector de
fluoresencia

Elaboró Revisó Aprobó

Jhonattan Baez Laura Camargo Fabiola Otálora


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3 PROCEDIMIENTO

3.1 CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS


FASE MÓVIL Acetonitrilo- Agua 80:20
FASE ESTACIONARIA Fase reversa (columna C18 150x4,6mm, 5µm)
LONGITUD DE ONDA Excitación 360 nm, emisión 440 nm
VOLUMEN DE INYECCIÓN 100 µl
FLUJO 1,3 ml/min
TEMPERATURA DEL HORNO 30 °C
TIEMPO DE CORRIDA 22 min
G-1: 6,0 min
B-1: 9,0 min
TIEMPO APROXIMADO DE RETENCIÓN G-2: 15,0 min
B-2: 17,0 min

3.2 PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DERIVATIZANTE


3.3.1 En un tubo de 20 ml, agregar 1 mL de ácido Trifluoroacético y 0,5 mL de ácido acético glacial.
3.3.2 Agregar 3,5 ml de agua desmineralizada y mezclar

3.4 PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN ESTÁNDAR


3.4.1 Transferir 5 ml de una mezcla Acetonitrilo - Agua (50/50) en un tubo de ensayo.
3.4.2 Retirar 50 µL de esta solución con una transferpipeta
3.4.3 Añadir 50 µL del estándar de Aflatoxinas para HPLC (5.0 µg/mL de Aflatoxinas totales (2.0
µg/mL B1 G1 y 0.5 µg/mL B2 G2) en Acetonitrilo).

3.5 PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE TRABAJO


3.5.1 La solución de trabajo se prepara de tal modo que el área y altura de pico obtenidos, sean
similares a los de la muestra analizada, el analista deberá evaluar la dilución pertinente para
cada caso.

3.6 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA


3.6.1 Pesar 50g de muestra molida y 4g de Cloruro de Sodio y transferirlo cuantitativamente a un
vaso de licuadora de 1L
3.6.2 Añadir 100 ml de solución de metanol (80%) y licuar a alta velocidad por 2 minutos.
3.6.3 Filtrar la muestra con papel filtro de filtración intermedia, o centrifugar a 5000 rpm durante 10
minutos.
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3.6.4
3.6.5 Transferir 2ml de filtrado y 14 ml de buffer fosfato salino (PBS) a una jeringa plástica adaptada
a la columna de inmunoafinidad (ver figura 1)La mezcla se hacer pasar a través de la columna
de inmunoafinidad a un flujo de 2ml/min (también es posible dejar que la mezcla pase a
través de la columna por efecto de la gravedad). Un flujo lento y estable es esencial para que
las aflatoxinas sean retenidas por los anticuerpos contenidos en la columna.
3.6.6 Lavar la columna de inmunoafinidad pasando 20 ml de buffer fosfato salino (PBS) a un flujo de
5 ml/min. Pasar aire a través de la columna para retirar los restos de solvente.
3.6.7 Para eluir las aflatoxinas se hace pasar por la columna de inmunoafinidad 1.5 ml de Metanol al
100% a un flujo de una gota por segundo, y se recoge en un tubo de ensayo.
3.6.8 Una vez se ha recogido la totalidad del metanol en el tubo, poner la tapa inferior a la columna
y verter el contenido del tubo de nuevo en la columna. Retirar la tapa y recoger el metanol en
el mismo tubo. Este procedimiento se realiza dos veces mas para asegurar la liberación
completa de las toxinas en el metanol.
3.6.9 Pasar 1.5 ml de agua desmineralizada a través de la columna y recogerlos en el mismo tubo,
para completar 3ml de extracto.

Figura 1. Montaje para el lavado y elución de la columna

3.7 DERIVATIZACIÓN
3.7.1 Para la derivatización, agregar 300 µL de la solución del estándar o muestra y 700 µL de
solución derivatizante en un vial, tapar el vial y agitarlo en vortex.
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3.7.2 Calentar el vial en baño termostatado por 9 minutos a una temperatura de 65°C.
3.7.3 Dejar enfriar hasta temperatura ambiente.
3.7.4 Inyectar en el cromatógrafo.

4 CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

Se deben tener mínimo dos inyecciones de estándar y dos inyecciones de muestra. Se calcula el
promedio de estas dos inyecciones, para calcular el contenido de cada alfatoxina se usa la siguiente
ecuación.

A muestra x Cstd xV i x Fdm x 1000


[ ContenidoAflatoxina ] =
A std xW muestra x Fdstd

Donde
A muestra: área promedio de la muestra
A std: área promedio del estándar
C std: concentración en mg/L del estándar
W muestra: peso inicial de la muestra
Fdm= factor de dilución de la muestra (nota: este factor corresponde al volumen de elución de la
columna (3mL) dividido la alícuota de muestra pasada por la columna (2mL))
Fdstd = Factor de dilución del estándar (corresponde a todas las diluciones realizadas al estándar
para la cuantificación)

El resultado se expresa como µg/Kg

5 DOCUMENTOS ASOCIADOS

CÓDIGO DOCUMENTO UBICACIÓN


Instructivo para el manejo del cromatógrafo SISTEMA DE CALIDAD/SGC
líquido DOCUMENTOS ORIGINALES
SISTEMA DE CALIDAD/SGC
MANEJO DE SOFTWARE EZCHROM
DOCUMENTOS ORIGINALES
Easy Extraction Aflatoxin. Product Code:
RP/RP70N. Manual de Uso columnas de afinidad.
AOAC Official Method 999.07
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