INSTRUCTIVO DE ANALISIS DE CODIGO: INS-04

VERSIÓN 01
BACTERIAS MESÓFILAS POR EL
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METODO DE FILTRACION POR
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1. OBJETIVO

Documentar el procedimiento para la determinación de bacterias mesófilas totales

(heterótrofos) por la técnica de filtración por membrana usando agar Plate Count como
medio de cultivo.

2. ALCANCE

La técnica se recomienda para el análisis y monitoreo de cambios en la calidad

bacteriológica de aguas superficiales durante su tratamiento y distribución, y para la
determinación de la densidad bacteriana en aguas de piscinas y aguas envasadas, entre
otras. Método de selección ideal para aguas con bajos recuentos.

3. METODOS DE REFERENCIA

Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, ed 22th.

Método 9215D: “Heterotrophic plate count: Membrane filter method”
Resolución 2115 de 2007

4. CONTENIDO

5.1 Características del microorganismo y del medio de cultivo

Heterótrofos viables: Grupo de bacterias con capacidad de crecer y desarrollarse entre los
25 y 37° C.

El método se basa en la filtración de volúmenes determinados de muestra según el tipo

de matriz al que correspondan sea agua potable o recreacional, a través de un filtro de
membrana con un tamaño de poro de 0.45µm, las bacterias quedan retenidas en la
superficie de la membrana, la cual es transferida a una caja de petri que contiene el medio
de cultivo, agar Plate Count (PCA).
Las bacterias asimilan los elementos nutricionales del medio y después de un periodo de
incubación de 48 horas se desarrollan colonias que pueden ser observadas con la ayuda
de un contador de colonias.

Las colonias de bacterias heterotróficas o mesófilas son lisas, de borde definido y tamaño
inferior a las colonias de hongos, sus colores varían, pueden ser amarillo oro, beige,
blancas cremosas o transparentes.

Este método sirve como herramienta para determinar la densidad bacteriana en los
diferentes tipos de matrices mencionados arriba. Mediante éste se pueden detectar
cambios en la calidad del agua en un sistema de distribución, la efectividad de la
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desinfección con cloro, así como la posible existencia de conexiones cruzadas,

acumulación de sedimentos y otros problemas dentro de la red de distribución. También
puede ser utilizado para monitorear cambios en el agua envasada o en casos de
emergencia en sistemas de suministro de agua.

Interferencias: La técnica presenta limitaciones cuando se trabajan aguas con alta

turbiedad, pues puede provocar el taponamiento de los filtros. El recuento de colonias por
reflexión de la luz contra la superficie blanca del filtro puede dificultar la lectura. Una
excesiva presión de filtración puede ocasionar daño celular.

5.2 Equipo

 Equipo de filtración
 Bomba de vacío
 Cabina de flujo laminar vertical
 Cuenta colonias
 Incubadora a 35±0.5° C.
 Autoclave

5.3 Materiales

 Cajas de petri de 50 x 11mm

 Filtros de membrana estériles de 0.45 u y 47mm de diámetro sin PAD.
 Pinzas

5.4 Reactivos y medios de cultivo

 Agua peptonada 0.1%

 Agar Plate Count deshidratado.

5.5 Fundamento de la técnica

Antes de realizar la filtración se debe verificar lo siguiente:

 Equipo de filtración: Estéril y conectado al sistema de vacío.
 Selección de las muestras a ser analizadas.
 Agua destilada hervida: Se utiliza para enjuagar los filtros entre muestra y muestra.
 Cuando se vayan a realizar filtraciones de muestras para sembrar en otros medios de
cultivo diferente al Plate Count, se recomienda empezar por la siembra en este medio.
 Marcar la caja de petri (por el lado de la base de la caja) que contiene el medio de
cultivo estéril.

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 Se pueden humedecer las rejillas de los filtros con agua destilada caliente antes de
colocar los filtros de membrana para una mejor adherencia de éstos a la rejilla.
 Con una pinza estéril tomar el filtro de membrana estéril y colocarlo sobre el
portafiltro o frita.

5.5.1 Procesamiento de la muestra

 La muestra debe estar a Tº ambiente para poder ser procesada.

 Agitar bien en agitador vortex o en su defecto mediante suaves movimientos por
inversión.
 Filtrar 100 ml de la muestra, indicados mediante la línea superior del embudo.
 Filtrar a través del filtro de membrana estéril de 0.45 u, una vez culminada la filtración
de la muestra ubicar la membrana sobre el medio ayudados de unas pinzas estériles.
 Incubar 48 horas a 35°C ± 0,5.
 Entre una tanda de muestras adicionar agua destilada hervida durante 4 minutos.
 Cuando la turbiedad del agua es mayor de 5 UNT se filtran volúmenes inferiores a 100
ml, volúmenes que varían entre 20, 30 y 50 mL según el aspecto de la muestra. En
estos casos el volumen debe ser medido en probeta esterilizada, se adiciona al
embudo y se ajusta con agua tamponada a 100ml, directamente en el embudo.

5.6 Cálculo e interpretación de resultados

Finalizado el periodo de incubación se procede a hacer lectura de la muestra, para

aquellos casos en los cuales existan colonias proceder a hacer el recuento de las mismas
con la ayuda del contador de colonias.
Reporte: Los resultados de la densidad bacteriana determinados por el procedimiento de
filtro de membrana se reportan como:
 Unidades formadoras de colonias UFC/ 100ml: Cuando en el cultivo no hubo
crecimiento de colonias el resultado es registrado como 0 UFC/100 mL.
Para calcular el número de colonias se utiliza la siguiente expresión:

UFC/100 ml= Colonias contadas x 100ml

Vol. De muestra filtrada

 Cuando hay menos de 2 colonias por cuadro (cuadrícula del filtro de membrana),
contar todas las colonias de la membrana y reportar el número de colonias obtenido
en 100 mL.

 De 3 a 10 colonias por cuadro, contar 10 cuadros significativos y obtener el promedio

del conteo por cuadro.

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 De 10 a 20 colonias por cuadro, contar 5 cuadros significativos y obtener el promedio

del conteo por cuadro.

Reporte final: para el reporte final se reemplaza el promedio de colonias contadas en la

siguiente fórmula.

UFC/100 ml= Promedio de Colonias contadas x100 x 100ml

Volumen de muestra filtrada

Ejemplo: si se contaron 5 cuadros significativos de la cuadrícula y el promedio nos da 15

colonias, el reporte final será: 1500 UFC/100 mL.

Si hay más de 20 colonias por cuadro reportar el conteo como ≥2000 por el volumen de
muestra sembrado, que normalmente son 100mL.

Nota: Cuando ha sido necesario hacer la siembra con diluciones de la muestra, hallar el
número de UFC como se indicó anteriormente y multiplicar por el factor de dilución al que
se sembró la muestra, teniendo presente la siguiente tabla:

FACTOR POR EL QUE SE

DILUCIÓN SEMBRADA MULTIPLICA (FD)
10-1 10
10-2 100
10-3 1000

Ejemplo: En una muestra sembrada a una dilución de 10 -2 se obtuvo un promedio 50

UFC; para este caso el reporte sería:

UFC/100 ml= 50 UFC x 100 x 100ml x 100 (FD) = 500000 UFC/ 100ml
100

Una vez realizado el recuento reportar los resultados en el cuaderno de análisis

microbiológicos especificando los datos de fecha y hora de incubación y de la misma
manera fecha y hora de lectura.

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5. REGISTROS
 FOR-036 Formatos de datos primarios de análisis fisicoquímicos y
microbiológicos de aguas tratadas y no tratadas.
 FOR-039 Formatos de datos primarios de análisis fisicoquímicos y
microbiológicos de piscinas.

6. ANEXOS

N.A

7. CONTROL DE CAMBIOS

Versión Quien la propuso

Descripción de Cambios Fecha
Nueva (cargo)

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