UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DEL USUMACINTA

División Académica Paramédico Y Biotecnología

Materia: Biología Molecular

ACTIVIDAD DE
INVESTIGACIÓN

Carrera: Ing. En Procesos Biotecnológicos

Cuatrimestre: 10mo

Grupo: A

23 de noviembre del 2023.

 MÉTODOS ACTUALES DE SECUENCIACIÓN AUTOMATIZADA

La Secuenciación de ADN es un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya finalidad

es la determinación del orden de los nucleótidos (A, C, G y T) en un oligonucleótido de ADN.
La secuencia de ADN constituye la información genética heredable del núcleo celular, los
plásmidos, la mitocondria y cloroplastos que forman la base de los programas de desarrollo
de los seres vivos.

SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA EMPLEANDO EL METODO ENZIMÁTICO

Es una alternativa al método de Sanger. Consiste en marcar el oligo cebador o los

terminadores con un compuesto fluorescente y activar la reacción de secuencia. Los
productos de la reacción se detectan directamente durante la electroforésis al pasar por
delante de un láser que al excitar los fluoróforos permite detectar la fluorescencia emitida.

SECUENCIACIÓN EMPLEANDO CEBADORES FLUORESCENTES

Se realizan cuatro reacciones de secuencia distintas en cada una de las cuales se añade el
oligonucleótido marcado en 5´ con una sonda fluorescente distinta, junto con la polimerasa,
los dNTPs y el ddNTP correspondiente. Las sondas empleadas son:

para A ---> JOE. Emisión: verde. Derivado de fluoresceína

para C ---> FAM. Emisión: azul. Derivado de fluoresceína
para G --> TAMRA. Emisión: amarillo. Derivado de rodamina
para T --> ROX. Emisión: rojo. Derivado de rodamina

Durante la electroforésis las bandas del ADN de cadena sencilla pasan a través de un láser
de argón que excita las sondas fluorescentes, la señal de emisión de fluorescencia, una vez
amplificada, es detectada a través de un filtro y asignada a la base correspondiente

SECUENCIACIÓN UTILIZANDO TERMINADORES FLUORESCENTES

De modo alternativo, la secuenciación puede llevarse a cabo empleando

terminadores marcados cada uno con un fluoróforo diferente. Esta química es más
sencilla porque permite llevar a cabo la reacción en un solo tubo, en que se
añaden los cuatro terminadores marcados.
 SECUENCIADORES AUTOMÁTICOS

SECUENCIADORES AUTOMÁTICOS CAPILARES

El equipo funciona de forma completamente automática

inyectando las muestras (que se preparan exactamente igual
que durante la secuenciación en geles y se colocan en una
placa de 96 pocillos), en un capilar previamente cargado con un cierto polímero que funciona
como lo hace la matriz de acrilamida/ bisacrilamida: urea de los geles de secuencia,
permitiendo resolver fragmentos de ADN de cadena sencilla que se diferencian en una única
base.

Las principales ventajas de estos nuevos equipos son:

o Automatización completa de todo el proceso, no siendo necesaria siquiera la presencia de

un técnico que cargue las muestras en los diferentes capilares del equipo.
o Rapidez en el análisis de cada muestra: dado el pequeño diámetro de los capilares, se
pueden aplicar voltajes mayores que en los geles de acrilamida:bisacrilamida:urea, por lo
que pueden leerse del orden de 450 nucleótidos en el plazo de una hora mientras que
esta misma longitud de secuencia necesita unas 2-4 horas en un secuenciador en gel.
o El tiempo necesario del proceso es. para la polimerizacion del mismo, unas dos horas y
para la preelectroforesis, una hora aproximadamente.

SECUENCIACION AUTOMATICA EN GELES DESNATURALIZANTES DE

ACRILAMIDA/BIS

La secuenciación automática mediante geles desnaturalizantes, se realiza polimerizando un

gel de acrilamida/bis entre dos cristales montados adecuadamente sobre el cassette que
sirve de soporte para los mismos y que posteriormente se acopla en el secuenciador
automático para proceder a la carga de la muestras.
El número de muestras que podemos cargar en cada
gel, viene determinado por el número de pocillos que
posee el peine (de dientes de tiburón) que
utilicemos. Hay peines de cuatro tamaños distintos:
de 36, 48, 64 y 96 pocillos.

La electroforesis se desarrolla durante 7

horas, y se puede realizar una lectura de unos 700pb aproximadamente, dependiendo
siempre de la calidad del ADN, de la correcta cuantificación del mismo, de la
utilización del primer adecuado, y de la polimerización correcta del gel de
acrilamida/bis principalmente.