Universidad Central del Ecuador

Facultad de Ciencias Médicas

Laboratorio Clínico e Histotecnológico
Cátedra de Biología Molecular
Msc. Cristina Toscano

Integrantes: Córdova Josselyn

Díaz Alexander
Erazo Mishell
Garzón María José
Fecha: 25 de abril de 2018

EXTRACCIÓN DE ADN
El ADN es una molécula llamada ácido desoxirribonucleico, la cual contiene las
instrucciones biológicas que hacen de cada especie algo único. Varios estudios
de Biología Molecular comienzan con la extracción de ácidos nucleicos. La lisis
celular libera las moléculas en una fase acuosa que es separada de los restos
celulares por centrifugación. Las proteínas son removidas de la fase acuosa
con solventes orgánicos como fenol y cloroformo. El ADN, que permanece en
la fase acuosa, precipita junto al etanol y posteriormente es purificado y
suspendido en un buffer adecuado.
Los pasos a realizar en un laboratorio son los siguientes:
1. Triturar el tejido para separar las células.
2. Lisis de las membranas celulares con detergente, en solución salina para
liberar los ácidos nucleicos y las proteínas.
3. Digestión de las proteínas por acción enzimática de proteasas.
4. Precipitación con etanol helado. El DNA es soluble en alcohol, pero se torna
insoluble en presencia de sal (NaCl) porque el sodio neutraliza la carga
negativa de los grupos fosfatos. El etanol formará una capa en la superficie por
ser menos denso que la solución acuosa.
5. Observación de agregados moleculares, de consistencia mucoidea, en la
interfase entre la solución acuosa y el alcohol.
 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
La Reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas
en inglés PolymeraseChainReaction, es una técnica de biología molecular
descrita en 1985 por KaryMullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de
copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría
basta partir de una única copia de ese fragmento.
La tecnología de la PCR está siendo aplicada en numerosos campos de
investigación: gracias a esta técnica se pueden detectar enfermedades víricas,
o tomar unas cuantas células fetales de la sangre de una mujer embarazada y
realizar un análisis genético.
La técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN, lo cual resulta mucho
más fácil identificar con una muy alta probabilidad virus o bacterias causante de
una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación
científica sobre el ADN amplificado.
El fundamento principal del técnica esla propiedad natural del ADN polimerasa
para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplea ciclos de altas y bajas
temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas
entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a
unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas.
Debido a la elevada sensibilidad de la técnica, uno de los puntos más
importantes a la hora de realizar una PCR, es la calidad del material de partida.
Por ello, la extracción de los ácidos nucleicos de la muestra toma un papel
crítico y fundamental.
La PCR es un método rápido de amplificación in vitro de secuencias de ADN
específicas dentro de una muestra. Habitualmente la reacción se diseña para
permitir la amplificación selectiva de una o varias secuencias diana de ADN
presente en una mezcla compleja de secuencias (por ejemplo ADN genómico
total). Para que la amplificación sea posible es absolutamente necesario
disponer de un mínimo de información sobre la secuencia a amplificar. Esta
información permite la construcción de dos oligonucleótidos (oligos),
habitualmente de 15 a 30 nucleótidos de longitud.
Es una reacción en cadena porque las hebras de ADN de nueva síntesis sirven
a su vez de molde para reacciones de síntesis en ciclos posteriores. Tras unos
30 ciclos, la PCR habrá generado aproximadamente un millón de copias de la
secuencia diana específica.
Una vez amplificado el ADN se dispone ya de cantidad suficiente como para
que este pueda ser caracterizado. Como en otros sistemas, se puede utilizar el
método de Souther, con digestión enzimática y análisis de los fragmentos por
electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio y detectarlos
como bandas discretas de un tamaño específico; o bien, detectar directamente
una cierta secuencia en el producto de amplificación si se cuenta con sondas
adecuadas. Se utiliza una ADN polimerasa termoestable debido a que la
reacción pasa por ciclos en los que se cambia la temperatura, de esta manera
se evita añadir la enzima manualmente en cada ciclo
Materiales
ADN molde: fragmentos de ADN donde se obtendrá la parte de la que se
desea generar muchas copias.
Iniciadores o “primers”: son dos secuencias cortas de ADN que se unen al
ADN molde. Están constituidos por 20 nucleótidos o más y su función es dar
inicio a la reacción de PCR.
dNTPs: son nucleótidos que sirven para generar las nuevas cadenas de ADN.
Polimerasa: es una proteína sirve para duplicar el ADN molde.
Iones: son elementos químicos cargados positivamente necesarios para la
función de la polimerasa.
Termociclador: aparato que automatiza la PCR.
 Procedimiento
 Mezcla maestra: es la mezcla de todos los componentes para llevar a
cabo la PCR colocados dentro de un recipiente y con un volumen muy
pequeño (ADN molde, iniciadores, dNTPs, iones y polimerasa); para
después ser colocados en el termociclador.
 Desnaturalización del ADN: se calienta la mezcla maestra a 95°C por 5
minutos (aprox.) para separar el ADN que es de doble cadena.
 Alineación: se baja la temperatura alrededor de 55-65°C para que se
unan los iniciadores al ADN molde.
 Extensión: se eleva la temperatura a 72°C y la polimerasa comienza a
duplicar el ADN molde. Ciclo de PCR: terminando la extensión se repite
todo el proceso (30-35 veces).
 Cuantificación: proceso por el cual se mide la concentración del ADN de
la PCR mediante un equipo llamado espectrofotómetro.
 Cada uno de los ciclos consta de las tres etapas siguientes:
1) Desnaturalización del ADN bicatenario presente en la muestra: típicamente
calentando la muestra a 93-95º C, durante unos 30 segundos, se consigue la
separación de la doble hélice en dos cadenas sencillas por rotura de los
enlaces de hidrógeno y consiguiente desapareamiento de las bases
complementarias.
2) Unión específica de los cebadores a las cadenas sencillas
mediantecomplementariedad de bases: a temperaturas que varían entre 50 y
70 oC,dependiendo de la Tm (temperatura de fusión) del duplex esperado y
durante untiempo aproximado de unos 20 segundos, cada uno de los primers
se une a unacadena diferente delimitando la secuencia diana que se pretende
amplificar.
3) Síntesis de ADN: típicamente a 70-75 oC, comienza a funcionar la
replicaciónincorporando nucleótidos sobre los primers y haciendo una copia
completa y exactade la cadena molde.
Resultado
 Múltiples copias de ADN provenientes de un fragmento ADN deseado.
 Fuentes de error más frecuentes
 Calidad del ADN
 Baja concentración de ADN
 Alta concentración de sales
 Diseño erróneo de iniciadores o “primers”
 Errores comunes en las técnicas de biología molecular
Aplicaciones
 Técnicas biotecnológicas
 Secuenciación
  Filogenia
 Ancestría
 Genotipificación
 Ciencias Forenses
Aplicaciones clínicas de la técnica
 Test de paternidad 

La muestra biológica (sangre, uñas, hisopados o cualquier otro tejido que

contenga células humanas con núcleo).

 Extracción del DNA del parásito que produce la enfermedad de chagas.  

Usando el método Extracción de DNA de sangre periférica con Bromuro de

Cetiltrimetilamonio (CTAB), se dejó listo el DNA para ser analizado mediante el
método de amplificación PCR.

Bibliografía
o Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) [Internet]. Conogasi. 2018
[Recuperado el 24 abril 2018]. Disponible en:
http://conogasi.org/articulos/reaccion-en-cadena-de-la-polimerasa-pcr-2/
o Reacción en cadena de polimerasa [Internet]. Cultek. 2018 [Recuperado
el 24 abril 2018]. Disponible en: http://www.cultek.com/aplicaciones.asp?
p=Aplicacion_PCR&opc=introduccion
o Andrea Ramos.(2010).Usos para la extracción de ADN.ArticuloTV.
[Recuperado el 24 abril 2018]. Disponible en:
http://www.articulo.tv/Usos-para-extraccion-adn_7401
o Ana Maria Perez Castro. Reaccion en Cadena de la polimerasa .
Universidad Politecnica de Valencia. [Recuperado el 24 abril 2018].
Disponible en:
https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/10700/Reacci%C3%B3n
%20en%20cadena%20de%20la%20polimerasa.pdf