UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SINALOA

UNIDAD ACADÉMICA ESCUELA DE BIOLOGÍA

LICENCIATURA EN BIOMEDICINA

TEMA: MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN DE ADN

MATERIA: GENÓMICA
PROFESORA: MC. CLAUDIA DESIRRE NORZAGARAY
ALUMNA: CALDERÓN RESENDIZ LIZETH MARICRUZ
GRUPO: 3-03
FECHA: 11-02-22
 MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN DE ADN

MÉTODOS CLÁSICOS DE SECUENCIACIÓN

Los dos protocolos clásicos de secuenciación (método químico y enzimático)
comparten etapas comunes.
 Marcado: Es necesario marcar las moléculas a secuenciar radiactiva o
fluorescentemente
 Separación: Cada protocolo genera una serie de cadenas sencillas de ADN
marcadas cuyos tamaños se diferencian en una única base. Estas cadenas
de distintas longitudes pueden separarse por electroforesis en geles
desnaturalizantes de acrilamida-bisacrilamida-urea, donde aparecen como
una escalera de bandas cuya longitud varía en un único nucleótido.
Para obtener estas cadenas se emplean dos procedimientos:
 Método químico de Maxam y Gilbert
Originalmente descrito por A. Maxam y W. Gilbert en 1977.
Esta técnica consiste en romper cadenas de ADN de cadena sencilla marcadas
radiactivamente con reacciones químicas específicas para cada una de las
cuatro bases. Los productos de estas cuatro reacciones se resuelven, por
electroforésis, en función de su tamaño en geles de poliacrilamida donde la
secuencia puede leerse en base al patrón de bandas radiactivas obtenidas.
Un fragmento de ADN se marca radiactivamente en sus extremos con gamma
32P ó gamma 32S dATP por acción de la polinucleótido quinasa. La técnica
consiste en romper estas moléculas marcadas con reacciones químicas
específicas para cada una de las cuatro bases. Cuatro alícuotas de la misma
muestra se tratan bajo condiciones distintas, posteriormente el tratamiento con
piperidina rompe la molécula de ADN a nivel de la base modificada. Los
productos de estas cuatro reacciones se resuelven en función de su tamaño en
geles de poliacrilamida donde la secuencia puefe leerse en base al patrón de
bandas radiactivas obtenidas. Esta técnica permite la lectura de unas 100
bases de secuencia.

 Método enzimático de Sanger

Este método de secuenciación de ADN fue diseñado por Sanger, Nicklen y
Coulson también en 1977 y se conoce como método de los terminadores de
cadena o dideoxi.
Para este método resulta esencial disponer de un ADN de cadena simple
(molde) y un iniciador, cebador o "primer" complementario de una región del
ADN molde anterior a donde va a iniciarse la secuencia. Este cebador se utiliza
como sustrato de la enzima ADN polimerasa I que va a extender la cadena
copiando de forma complementaria el molde de ADN.
Proceso:
Se diseña un oligonucleótido sintético de unos 17-20 bases complementario de
la cadena de ADN que se quiere secuenciar y situado a unos 20-30 bases de
distancia del comienzo de la secuencia que se quiere leer. Si este oligo se
diseña fuera de la región de clonaje de los plásmidos podrá emplearse el
mismo oligo para secuenciar distintos insertos.

El dúplex formado entre el oligo y el ADN complementario de cadena sencilla

se convierte en sustrato de la ADN polimerasa I que va a extender la cadena
desde grupo OH libre del extremo 3´ del oligo, incorporando dNTPs y copiando
el molde de ADN al sintetizar la cadena complementaria. Como enzima se
emplea el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I que carece de actividad
 exonucleasa 5´- 3. También pueden emplearse otras polimerasas como la Taq
polimerasa o la polimerasa del fago T7.
Durante la secuenciación se llevan a cabo cuatro reacciones de síntesis
separadas incluyendo en cada una de ellas pequeñas cantidades de los
dideoxinucleótidos (ddNTP: ddGTP; ddATP, ddCTP, ddTTP) que carecen de
extremo 3´ OH libre y que al incorporarse en la cadena de ADN que se esta
sintetizando acaban con la elongación de la misma.
La incorporación al azar de un ddNTP en competición con el dNTP
correspondiente, implica la formación de una mezcla de cadenas de distintas
longitudes, todas ellas empezando en el extremo 5´ y acabando en todas las
diferentes posiciones posibles donde un ddNTP puede incorporarse en lugar
de un dNTP. El promedio de longitud de las cadenas puede alterarse
modificando la relación dNTP/ddNTP en la mezcla de reacción. Por ejemplo,
aumentando la concentración de ddNTP aumenta el número de cadenas de
pequeña longitud al aumentar la frecuencia de incorporación de este tipo de
nucleótidos.
La sustitución de uno de los dNTPs por el mismo nucleótido marcado
radiactivamente permite la visualización de las bandas de distinta longitud en
un gel de poliacrilamida donde cada una de las reacciones se carga en un
carril. En el gel la separación de las distintas bandas se produce en función de
su tamaño y la secuencia puede determinarse leyendo las bandas de los
cuatro carriles. En este tipo de geles pueden leerse hasta 300 bases. En
carreras más largas la lectura puede llegar a ser de hasta 500 bases.

SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA EMPLEANDO EL METODO ENZIMÁTICO

Es una alternativa al método de Sanger. Consiste en marcar el oligo cebador o los
terminadores con un compuesto fluorescente y activar la reacción de secuencia.
Los productos de la reacción se detectan directamente durante la electroforésis al
pasar por delante de un láser que al excitar los fluoróforos permite detectar la
fluorescencia emitida.
Secuenciación empleando cebadores fluorescentes
Se realizan cuatro reacciones de secuencia distintas en cada una de las
cuales se añade el oligonucleótido o cebador marcado con una sonda
fluorescente distinta y un ddNTP diferente en cada una de ellas. Al finalizar
las cuatro reacciones se mezclan en un único tubo.
Se realizan cuatro reacciones de secuencia distintas en cada una de las
cuales se añade el oligonucleótido marcado en 5´ con una sonda
 fluorescente distinta, junto con la polimerasa, los dNTPs y el ddNTP
correspondiente. Las sondas empleadas son:
para A ---> JOE. Emisión: verde. Derivado de fluoresceína
para C ---> FAM. Emisión: azul. Derivado de fluoresceína
para G --> TAMRA. Emisión: amarillo. Derivado de rodamina
para T --> ROX. Emisión: rojo. Derivado de rodamina
Durante la electroforésis las bandas del ADN de cadena sencilla pasan a
través de un láser de argón que excita las sondas fluorescentes, la señal de
emisión de fluorescencia, una vez amplificada, es detectada a través de un
filtro y asignada a la base correspondiente

Secuenciación empleando terminadores fluorescentes

Se realiza una única reacción de secuencia en presencia de los cuatro
ddNTPs, cada uno de ellos marcados con una sonda fluorescente distinta.
De modo alternativo, la secuenciación puede llevarse a cabo empleando
terminadores marcados cada uno con un fluoróforo diferente. Esta química
es mas sencilla porque permite llevar a cabo la reacción en un solo tubo, en
que se añaden los cuatro terminadores marcados.

SECUENCIADORES AUTOMÁTICOS
Secuenciadores automáticos capilares
Existen instrumentos de electroforesis capilar que proporcionan una
alternativa clara al sistema basado en geles de acrilamida/bisacrilamida
donde este soporte ha sido sustituido por un polímero que se inyecta de
forma automática en un capilar antes de cargar la muestra de
secuenciación; las muestras se van analizando una a una. Este tipo de
secuenciadores se utiliza para lecturas no superiores a unos 450pb.
El equipo funciona de forma completamente automática inyectando las
muestras (que se preparan exactamente igual que durante la secuenciacion
en geles y se colocan en una placa de 96 pocillos), en un capilar
previamente cargado con un cierto polimero que funciona como lo hace la
matriz de acrilamida:bisacrilamida:urea de los geles de secuencia,
permitiendo resolver fragmentos de ADN de cadena sencilla que se
diferencian en una unica base.
A una altura determinada el laser detecta la fluorescencia emitida por cada
cadena sencilla de ADN fluorescente y traduce esta emision de
fluorescencia en la secuencia correspondiente. Una vez desarrollada la
electroforesis de la primera muestra, el capilar se vacía rellenandose
nuevamente con polímero fresco: Se inyecta a continuación una segunda
muestra,se procede a desarrollar nuevamente la electroforesis y así
sucesivamente. (ver diagrama)
Las principales ventajas de estos nuevos equipos son:
Automatización completa de todo el proceso, no siendo necesaria siquiera
la presencia de un técnico que cargue las muestras en los diferentes
capilares del equipo.
Rapidez en el analisis de cada muestra: dado el pequeño diámetro de los
capilares, se pueden aplicar voltajes mayores que en los geles de
acrilamida:bisacrilamida:urea, por lo que pueden leerse del orden de 450
nucleotidos en el plazo de una hora mientras que esta misma longitud de
secuencia necesita unas 2-4 horas en un secuenciador en gel.
El tiempo necesario del proceso es. para la polimerizacion del mismo, unas
dos horas y para la preelectroforesis, una hora aproximadamente.

Secuenciación automática en geles desnaturalizantes de

acrilamida/bisacrilamida
La secuenciación automática mediante geles desnaturalizantes, se realiza
polimerizando un gel de acrilamida/bisacrilamida entre dos cristales
montados adecuadamente sobre el cassette que sirve de soporte para los
mismos y que posteriormente se acoplará en el secuenciador automático
para proceder a la carga de la muestras.
La secuenciación automática mediante geles desnaturalizantes, se realiza
polimerizando un gel de acrilamida/bis entre dos cristales montados
adecuadamente sobre el cassette que sirve de soporte para los mismos y
que posteriormente se acopla en el secuenciador automático para proceder
a la carga de la muestras.
Proceso:
El número de muestras que podemos cargar en cada gel, viene
determinado por el número de pocillos que posee el peine ( de dientes de
tiburón) que utilicemos. Hay peines de cuatro tamaños distintos: de 36, 48,
64 y 96 pocillos.
 La electroforesis se desarrolla durante 7 horas, y se puede realizar una
lectura de unos 700pb aproximadamente, dependiendo siempre de la
calidad del ADN, de la correcta cuantificación del mismo, de la utilización
del primer adecuado, y de la polimerización correcta del gel de
acrilamida/bis principalmente.
Cuando las muestras a secuenciar tienen una longitud no superior a 400pb,
podemos disminuir el tiempo de la electroforesis a 3.5 horas, aumentando la
velocidad de barrido del laser, y el resultado es igualmente optimo.

Secuenciación de ADN empleando microarrays

Los microarrays constituyen la última línea de técnicas basadas en la interacción
de cadenas complementarias de ADN. Este tipo de técnicas introducen
básicamente dos nuevas innovaciones: el empleo de soportes sólidos no porosos
tales como cristal que facilitan la miniaturización y la detección basada en
fluorescencia y el desarrollo de métodos de síntesis in situ de oligonucleótidos a
altas densidades sobre el soporte sólido.
Existen muchas variedades de microarrays o ADN-chips como también se les
denomina. Desde los microarrays "artesanales" realizados en el laboratorio a los
ofrecidos por compañías de biotecnología, el principio que rige su diseño es el
mismo: la complementariedad de las cadenas aisladas de ADN: o propiedad de
las citadas cadenas de hibridarse con otras cadenas aisladas de ADN que posean
una estructura complementaria.
Básicamente un microarray consiste en una matriz de "pocillos"
microminiaturizados sobre un substrato de vidrio en donde se implantan, utilizando
diversas técnicas, cadenas simples de oligonucleótidos. El poder adherir una
cadena corta de oligo sobre una superficie plana es decisivo en el diseño de los
microarrays.
Existen dos técnicas para para acoplar los oligos a cada una de las celdas.
Implantar en cada celda, mediante un brazo robotizado, el oligonucleótido
presintetizado que corresponda.
Sintetizar en las propias celdas, mediante ciclos sucesivos de síntesis, los
oligonucleótidos correspondientes.
El proceso de síntesis "in situ" de los nucleótidos en el microarray se realiza en las
siguientes fases:
Elaboración previa de un mapa de distribución del tipo de oligonucleótido
correspondiente a cada celda del microarray.
Preparación del sustrato y deposición de una película fotodegradable.
Aplicación de una máscara que permita eliminar selectivamente la película
protectora en las zonas del microarray correspondiente a un determinado
nucleótido.
Incubación química y acoplamiento del nucleótido previsto.
Una nueva capa fotodegradable es aplicada sobre el microarray.
Se repiten los pasos anteriores para cada nucleótido hasta obtener la secuencia
prevista.
Se elimina definitivamente la película fotodegradable.

Pirosecuenciación
Se trata de un método simple y consistente, útil para la secuenciación de
fragmentos de ADN de tamaños pequeños o medianos.
Etapas del proceso:
Un cebador específico se une a una cadena de ADN sencilla en presencia de
dNTPS, ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa y apirasa así como de los
sustratos APS (adenosina 5 fosfosulfato) y luciferina.
El primero de los cuatro dNTPs se añade a la reacción. La ADN polimerasa
cataliza su incorporación a la cadena; si este dNTP es complementario de la
secuencia del ADN molde se libera PPi en una cantidad equimolar a la cantidad de
nucleótido incorporado.
La ATP sulfurilasa convierte cuantitativamente el Ppi en ATP en presencia de
APS. Este ATP media la conversión de luciferina en oxiluciferina por parte de la
luciferasa, produciéndose luz visible en intensidad proporcional a la cantidad de
ATP. Esta luz es detectada por una cámara CCD y se visualiza en el pirograma
como un pico, siendo la altura del pico proporcional al número de nucleótidos
incorporados.
La apirasa degrada de forma contínua tanto el ATP como los dNTPs no
incorporados apagando de esta forma la emisión de luz y regenerando las
condiciones para que pueda ser añadido un nuevo nucleótido en la reacción.
La adición de nucleótidos ocurre de uno en uno. Se sustituye el dATP por
dATPalfaS porque este sustrato es reconocido eficientemente por la ADN
polimerasa pero no por la luciferasa.