Prctica 11

Anlisis de ADN por electroforesis en gel de agarosa

Introduccin
La concentracin e integridad del ADN extrado, as como el tamao de
distintos fragmentos de ADN (por ejemplo, productos de PCR) pueden ser
verificadas mediante electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida.
La electroforesis consiste en la separacin de molculas (protenas,
isoenzimas, cidos nucleicos) a travs de una matriz tamponada (agarosa,
acrilamida, almidn). La matriz funciona como un filtro, separando las
molculas en un campo elctrico, de acuerdo al tamao y la carga neta
que poseen. En el caso de los cidos nucleicos, el grupo fosfato es el
responsable por la fuerte carga negativa en condiciones de pH neutro,
haciendo que los fragmentos migren hacia el polo positivo (nodo) durante
la electroforesis

La resolucin y velocidad de separacin de fragmentos de ADN por

electroforesis son reguladas a travs de la concentracin de agarosa (o
acrilamida) en el gel y el voltaje aplicado durante la electroforesis. La
agarosa funciona como un filtro en el que los fragmentos de menor tamao
migran ms rpidamente hacia el nodo que aquellos de mayor tamao. Al
aumentar la concentracin de agarosa se dificulta el movimiento de los
fragmentos a lo largo del gel, permitiendo obtener una mayor resolucin
en los fragmentos de menor longitud. El incremento del voltaje aumenta
proporcionalmente la velocidad de migracin de los fragmentos en el gel.
Los cidos nucleicos separados en geles de agarosa pueden visualizarse
mediante tincin con colorantes fluorescentes, lo cual permite evaluar su
integridad y estimar su concentracin mediante un anlisis comparativo
con patrones de concentracin conocida. Los colorantes fluorescentes
actan mediante insercin entre las pares de bases que conforman el
cido nucleco. El bromuro de etidio es ampliamente utilizado para la
visualizacin de ADN y ARN. Sin embargo, ste es un reactivo altamente
txico, con propiedades mutagnicas, por lo que debe ser manejado con
extremo cuidado en el laboratorio. En la actualidad existen colorantes
fluorescentes alternativos, como SYBR Safe, SYBR Gold, SYBR Green I,
Vistra Green y Syto60, desarrollados especficamente para reducir los
riesgos potenciales de mutagnesis.

La tcnica para la cuantificacin de ADN consiste simplemente en la

utilizacin de una secuencia de concentraciones de solucin patrn de ADN
con la que se comparan muestras de ADN de concentracin desconocida.
El clculo de las concentraciones se hace bajo la luz ultravioleta segn la
fluorescencia. Debe evitarse la exposicin prolongada a la luz ultravioleta,
incluso con mscara de proteccin. La estimacin de las concentraciones
de ADN puede realizarse sobre una fotografa digital del gel tomada bajo
luz ultravioleta si se cuenta con un analizador de imgenes.
La concentracin de agarosa y el voltaje con los que se debe trabajar
depende del tamao del segmento de ADN que se quiera visualizar. Los
segmentos de gran tamao, el del ADN total (proveniente de una
extraccin de ADN), deben trabajarse con concentraciones del 0.8% y a
voltajes de 60V para evitar la fragmentacin del mismo. Los segmentos de
1500pb en adelante con geles al 1%, los segmentos de 500pb a 1500pb en
geles 1,5% o 2% y los pequeos segmentos de de 100pb a 500pb (los
microsatlites por ejemplo) en geles al 4% o 6%. Para estos el voltaje
puede variar de 20V a 120V de pendiendo de la velocidad a la que quiera
que migre el ADN, a voltajes elevados ms rpido corren las muestras.

Puntos a investigar antes de la prctica (incluir en la

bitcora):

1. Investigar la talla aparente de ADNs plasmdicos, ADN

cromosmico de E. coli, y ARNs.
2. Investigar qu son las enzimas de restriccin.
3. Investigar qu son los fragmentos de restriccin de un
polinucletido.
4. Investigar qu son los agentes intercaladores de ADN.
5. Qu son los polimorfismos de fragmentos de
restriccin? Para qu se han utilizado?

Protocolo:

Soluciones y reactivos
* Agarosa InvitrogenTM, UltraPureTMAgarose, Cat. 16500-100
(almacenar de 15-30C).
* Solucin tamponada para electroforesis (stock concentrado 10X),
InvitrogenTM, UltraPureTM 10X TBE, Cat. 15581-044 (almacenar de
15 a 30C). Solucin compuesta de:
1.0M Tris
0.9M cido Brico
0.01m EDTA
* Buffer de Carga con Azul de Bromofenol , BioRad Nucleic acid
sample loading buffer , 5x, Cat. 350001350 (almacenar a 4C).
* Marcador de talla (escalera), BioRad EZ Load Molecular ruler, 80
g/ml, 1 kb, Cat. 350001699 (almacenar a 4C).
* SYBR Safe DNA gel stain 10,000X (Fluorescent DNA stain),
InvitrogenTM MOLECULAR PROBES, Cat. 10488-058 (almacenar a
4C).
*Agua desionizada, grado R.O.

Protocolo:

Equipo
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Bao a 37oC.
Cmaras de electroforesis horizontales
Fuente de poder
Agitador tipo vortex
Agitador orbital
Sonicador de bao

Protocolo:

Procedimiento USAR GUANTES EN TODO MOMENTO

1. Preparacin de gel de agarosa (0.5 a 1.0% w/v es lo comn).
Para un gel de agarosa al 1.0%: dentro de un matraz Erlenmeyer de 250 ml, colocar 0.4g
agarosa + 36ml H2O destilada. Calentar durante 30 segundos en horno de microondas, para
obtener una solucin libre de grumos. Con la solucin a unos 50C, colocar 4mL de TBE 10X,
mezclar sin generar burbujas y verter los 40 ml dentro del molde para geles. Dejar gelificar
durante una 45 minutos.
2. Digestin del plsmido con las enzimas de restriccin (EcoRI, XhoI, HindIII)
Colocar en un tubo eppendorf de 0.6ml:
5ul del plsmido aislado
2ul de enzima de restriccin EcoR1/Xhol/HindIII
3ul de amortiguador 10X para ecoR1
xul H2O
Para tener 30ul finales
Incubar durante los 45min (en lo que gelifica gel) a 37C.
3. Sonicacin plsmido
En un tubo eppendorf, colocar 15ul de plsmido (con 500ng de DNA) y llevar a sonicar.
Sonicar durante 20min,

Protocolo:

Procedimiento USAR GUANTES EN TODO MOMENTO

4., Montaje del gel dentro de la cmara.
Una vez gelificada la agarosa, se retira el peine con cuidado y se coloca dentro de la cmara
de electroforesis junto con la charola de gelificacin. Enseguida, se agregan suficiente buffer
TBE 1X, de tal manera que el gel quede cubierto.
5.Cargado de Muestras. Las muestras a analizar son colocadas dentro de los pozos con
ayuda de micropipetas. El volumen a colocar dentro de los pozos es de 10 a 20 l. En ese
volumen, colocar muestras que contengan aproximadamente 200ng de DNA, mezcladas con 4
l de buffer de carga. Este buffer contiene azul de bromofenol, cuyo corrimiento se asemeja
normalmente a un nucletido de 500 pares de bases. El orden de cargado se anota en la
bitcora.
6. Corrida. La electroforesis se monta de tal manera que las muestras queden en el extremo
del gel cercano al nodo (carga negativa, negro). Usualmente, las corridas se realizan de 200
Volts durante 50 min, dependiendo de las muestras a analizar y de la migracin observada del
azul de bromofenol (para plsmidos <10 kDa, permitir que este colorante migre hasta llegar
al extremo del gel cercano al ctodo).
7. Tincin del gel. El DNA es marcado utilizando una solucin de Fast Blast DNA stain 100X.
Colocar el gel en una charola, agregar la solucin de tincin (no txica), e incubar durante 5
min en agitador orbital. Retirar la solucin de tincin (conservarla, pues sirve mltiples
veces), y lavar con agua desionizada varias veces, hasta eliminar la tincin de color azul en el
fondo del gel.

Haz tu electroforesis virtual:

http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/

Videos demostrativos:
Restriction digestion of DNA
http://www.youtube.com/watch?v=GsWo8dCivWs
How to caste a gel
http://www.youtube.com/watch?v=KKmiKKMDDhY
Agarose gel electrophoresis
http://www.youtube.com/watch?v=vq759wKCCUQ

Puntos a integrar en el reporte:

1. Clculos para depositar la cantidad adecuada de ADN sobre el
gel.
2. Tratamientos realizados al plsmido.
3. Imagen del gel obtenido.
4. Discusin sobre las formas del ADN plasmdico y
carctersticas relacionadas con cada una de ellas: forma
super-enrollada, forma(s) relajada(s), forma linearizada.
5. Discusiones personales.
6. Conclusiones.