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CITOGENETICA MOLECULAR

INTEGRANTES:
Licet Liliana VASQUEZ ROMAN
Noel Alexander MAMANI QUISPE



HIBRIDACION IN SITU
INTRODUCCION

HIBRIDACION
• La hibridación en Biologia Molecular es el
enlace de dos moleculas de acido nucleico de
caxdena simple, complementarias de acuerdo
con las reglas de emparejamiento de bases.

• En genetica de celulas somaticas, fusion de dos
celulas somaticas a menudo de organismos
diferentes para formar una célula hibrida que
contiene la informacion genetica de ambos
tipos de celulas.
A TRAVES DE LA HISTORIA
• 1969 Por Gall y Pardue, jhon et al se desarrollo
esta tecnica.
• Se empleo ovocitos de Xenopus Laevis,
hibridando rRNA con rDNA extracromosomal.
HIBRIDO
• Es un organismo vivo animal o vegetal
procedente del cruce de dos organismos de
razas, especies o subespecies distintas, o de
alguna o más cualidades diferentes.
METODOS DE HIBRIDACION
• Los ensayos de Hibridación se pueden
clasificar en tres grupos:
HIBRIDACION IN SITU
• La localizacion de un gen o de un segemento
de DNA en un extendido cromosomico o en un
nucleo de celulas, sobre un portaobjetos, con
huso de una secuencia marcada de DNA que
se debe localizar. Generalmente, conlleva el
uso de sondas fluorescentes en el caso se
denomina hibridacion in situ fluorescente.
• Es un tipo especializado de hibridación en
soporte solido en la que la sonda se aplica
sobre muestras en su ubicación natural,
generalmente preparadas para microscopia.
• Supone, por tanto , el empleo de hibridación
bajo un abordaje citológico e histológico y
metodológicamente es análoga a las técnicas
inmunocitoquimicas e inmunohistoquimicas.
De forma muy global cabe distinguir entre sus
aplicaciones tisular y cromosómica.

HIBRIDACION IN SITU TISULAR
• Se realiza sobre cortes de tejido, células
intactas, núcleos aislados… en muchos casos,
se lleva a cabo directamente sobre tejidos
fijados con formalina, incluidos en parafina,
congelados, etc.

HIBRIDACION IN SITU TISULAR
• Es una modalidad de hibridación
particularmente para detectar virus patógenos
para diagnosticas células cancerosas como
consecuencias de cambios genéticos o para
estudiar cambios en la expresión génica,
detectando secuencias en el RNA celular.

HIBRIDACION IN SITU TISULAR
• En este caso, tras una fijación suave se añaden
sondas de DNA complementario (cDNA), de
hebra sencilla.
• La detección se realiza por autorradiografía y
por examen de la película fotográfica bajo el
microscopio o por microscopia de
fluorescencia, si se empleo este marcaje para
la sonda.
HIBRIDACION IN SITU CROMOSOMICA
• Se realiza sobre preparaciones en porta de
cromosomas metafasicos y prometafasico,
tratadas con fijadores para preservar las
características morfológicas del cromosoma,
Para hacer accesible la secuencia de DNA, se
trata la muestra con enzimas proteolíticas y se
desnaturaliza en DNA por calor, álcalis o
formamida para permitir su hibridación con la
sonda.
HIBRIDACION IN SITU CROMOSOMICA
• Inicialmente se empelaron sondas radioactivas,
pero problemas técnicos en la detección de la
señal limitan su utilidad.
• Se a conseguido aumentar la sensibilidad y
resolución con el empleo de sondas marcadas
con fluorescencia.
• En esta técnicas llamando hibridación in situ por
fluorescencia o FISH, la detección se hace bajo
microscopia de fluorescencia, bien de forma
directa o por método indirecto.
PASOS Y CONSIDERACIONES PARA LA
HIBRIDACION IN SITU

DETECCION DE SONDA MARCADA



Sondas
Secuencia de nucleótidos
complementaria
de la secuencia diana a estudio
M
Sondas
Sondas antisentido y sentido
• SONDA ANTISENTIDO (Antisense): Secuencia de nucleótidos
complementaria de la secuencia diana
• SONDA SENTIDO (Sense, control negativo): Secuencia de
nucleótidos idéntica a la secuencia diana, por lo que no puede
hibridarse con ella
Secuencia
diana
Sonda antisentido
T A A g g T C C A 3’ 5’
A T T C C A g g T 5’ 3’
A C g C A T g A T 5’ 3’
A T T C C A g g T 5’ 3’
Sonda sentido
Sondas
Tipos de Sondas
• Sondas bicatenarias (ADN)
• Sondas monocatenarias
Número de hebras
• Sondas de ARN
(Ribosondas)
• Sondas de ADN
Naturaleza
• ARN
• Oligonucleótidos

Sondas
Tipos de Sondas
Sondas Bicatenarias
M
M
• Permiten la detección de ambas hebras del ADN
Sondas
Tipos de Sondas
Sondas Monocatenarias
• En ADN, permiten la detección de una de las hebras
M
• En ARN, es complementaria a su secuencia
Sondas
Marcadores
Son moléculas que se incorporan a un
nucleótido para permitir la detección de la
sonda.
M
Sondas
Marcadores
Tipos de marcadores
• Antigénico
s
• Fluorescente
s
• Inmunohistoquímica
• Visualización directa (FISH)
Sondas
Marcadores
Marcadores antigénicos
• Incorporan moléculas antigénicas acopladas a la base
nitrogenada
• Los más usadas son: Biotina, Digoxigenina y Fluoresceína
(FITC)
CH
2
O
OH OH
P O O
OH
OH

P O
OH
OH

P O
OH
OH

M
Sondas
Marcadores
Marcadores fluorescentes
• Incorporan fluorocromos acoplados a la base nitrogenada
• Los más usadas son: Fluoresceína, Rodamina, Texas red
CH
2
O
OH OH
P O O
OH
OH

P O
OH
OH

P O
OH
OH

M
Hibridación in situ
Procesamiento de las muestras
Fijación
Permite preservar los ácidos nucleicos y la morfología tisular
DNasas ¡RNasas!
Degradación de
ácidos nucleicos
diana
FIJACIÓN
Hibridación in situ
Procesamiento de las muestras
Fijador
FORMOL TAMPONADO 10%, pH 7.4, durante 24 horas
Procesado rutinario de inclusión en parafina
Evitar mezclas fijadoras que contengan Hg o ácidos
Bouin
Zenker
B5
!
Hibridación in situ
Procesamiento de las muestras
Secciones
Secciones de 5 µm en portaobjetos tratados
• Limpieza con alcohol (microtomo, baño, ...)
• Esterilización en autoclave (pinzas, ...)
Precauciones con las RNasas exógenas (condiciones de
esterilidad):
• Uso de agua destilada en el baño para recoger las secciones
• Portaobjetos de caja recién abierta
!
Hibridación in situ
Procesamiento de las muestras
Secado de las secciones durante
1 Noche a 50-55 ºC
Almacenamiento de las secciones desecadas a –20ºC
Si no se realiza la HIS
en los días siguientes
Precauciones con las RNasas
!
Hibridación in situ
Etapas
• Pretratamiento
• Desparafinado e hidratación
• Deshidratación
• Desnaturalización
• Hibridación
Hibridación in situ
Desparafinado e Hidratación
Se realizará de igual manera que la IHQ
Llevar la hidratación hasta Agua Destilada Estéril
Precauciones con las RNasas
!
Hibridación in situ
Pretratamientos
Calor
Precauciones con las RNasas
!
10 min, 95-99ºC
Baño María
Microondas
Hibridación in situ
Pretratamientos
Medios Enzimáticos
Precauciones con las RNasas
!
Enzimas
proteolíticas
PEPSINA (10 min TA / 5 min 37ºC )
PROTEINASA K (1 min TA)
Hibridación in situ
Deshidratación y secado
Precauciones con las RNasas
!
Evita la dilución de la sonda
La deshidratación se realiza con alcoholes de graduación creciente
OH 70º OH 96º OH 100º
El secado lo podemos
realizar
Al aire / campana
En placa térmica a 45-50ºC
Hibridación in situ
Desnaturalización
Permite la separación de las dos hebras de ADN para
que pueda ser detectada la secuencia a estudio
Sólo es necesaria cuando se pretenda detectar ADN
y/o cuando la sonda sea bicatenaria
Hibridación in situ
Desnaturalización
95ºC durante 5’
Hibridación in situ
Hibridación
La sonda se unirá a la secuencia diana
bajo unas condiciones determinadas
M
Hibridación in situ
Hibridación
Condiciones de hibridación
[Na
+
] Temperatur
a
M
M M
Hibridación in situ
Hibridación
Temperatura de hibridación
37ºC / 45ºC noche
Temperatura a la cual la sonda se hibridará con su
diana
Hibridación in situ
Lavados de rigor (astringency)
Permiten aumentar la especificidad de la reacción
eliminando las uniones inespecíficas de la sonda
con secuencias parcialmente homólogas
SSC 2X SSC 1X SSC 0,5X
SSC: Tampón citrato salino
Se realizan los lavados a 72ºC, 65ºC, 42ºC, 37ºC
Sistemas de Detección
• Biotina
• Estreptavidina
• Fluorocromos
• Ac. anti-fluorocromo
• Fluorescencia (FISH)
• Digoxigenina
• Ac. anti-digoxigenina
Sistemas de Detección
Sondas biotinadas
B
1. Detección mediante Estreptavidina unida a la
enzima (Fosfatasa alcalina o Peroxidasa)
E
Z

E
Z

Diana
2. Revelado con el cromógeno de la enzima
(NBT/BCIP o DAB)
Sistemas de Detección
Sondas biotinadas
EA-Peroxidasa DAB EA-Fosfatasa Alcalina
NBT/BCIP
Virus JC
Sistemas de Detección
Amplificación con tiramidas
B
P

P

1. Detección de sonda biotinada con Estreptavidina-
Peroxidasa
Sistemas de Detección
Amplificación con tiramidas
B
P

P

T
B
T
B
2. Tiramida-biotina oxidada por la peroxidasa se une a
residuos tirosina de proteínas próximas
T
B
T
B
Sistemas de Detección
Amplificación con tiramidas
B
P

P

T
B
P

P

T
B
P

P

T
B
P

P

T
B
P

P

3. Detección de la biotina de las tiramidas con más
Estreptavidina-peroxidasa
4. Revelado con DAB
Sistemas de Detección
Amplificación con tiramidas
Técnica convencional Amplificación con tiramidas
HPV
Sistemas de Detección
Amplificación con tiramidas
Caski (600 copias HPV16)
HPV
Sistemas de Detección
Amplificación con tiramidas
SiHa (1-2 copias HPV16)
HPV
Sistemas de Detección
Sondas antigénicas
A
E

1. Detección mediante un anticuerpo unido a una
enzima (Fosfatasa Alcalina o Peroxidasa)
2. Revelado con el cromógeno
(NBT/BCIP o DAB)
Antígeno
• Digoxigenina
• FITC
Detección por Inmunohistoquímica
Sistemas de Detección
Sondas antigénicas
EBV - EBER
FITC–FA NBT/BCIP
HIBRIDACION IN SITU FLUORESCENTE
Sistemas de Detección
Sistemas de Detección
Sondas marcadas con fluorocromos
FITC
Iluminación con luz de
alta frecuencia
(Ultravioleta)
Emisión de
fluorescencia de
frecuencia
inferior
Visualización directa de la fluorescencia (FISH)
Sistemas de Detección
Sondas Marcadas con Fluorocromos
HER-2/neu
Centrómer
o
Gen
HER2
FISH
(Fluorescence In Situ Hybridization)
Sondas Marcadas con Fluorocromos
HER-2/neu
Centrómer
o
Gen
HER2
FISH
(Fluorescence In Situ Hybridization)
Variantes (M-FISH y SKY-FISH)
Consisten en marcar el ADN de cada cromosoma
con un fluorocromo con espectro de emisión
único y diferenciable de lo demás
“Se pinta a cada cromosoma de un color”
Los cromosomas anómalos aparecerán no
uniformes
Útil en neos hematológicas
Caracteriza correctamente translocaciones
complejas y crípticas