Purificacion y análisis de

acidos nucleicos
• La extracción y purificación de ácidos nucleicos constituye la primara
etapa de la mayoría de los estudios de biología molecular y de todas
las técnicas de recombinación de ADN.
• La calidad y la pureza de los ácidos nucleicos son dos de los
elementos más importantes en ese tipo de análisis. Si se desea
obtener ácidos nucleicos muy purificados, que no contengan
contaminantes inhibidores, es preciso aplicar métodos de extracción
adecuados. Los contaminantes capaces de inhibir el análisis PCR
• Dada la gran variedad de métodos de extracción y purificación de ácidos
nucleicos existentes, la elección de la técnica más adecuada suele
efectuarse conforme a los criterios siguientes:
• ácido nucleico diana o de molde;
• organismo fuente;
• material inicial (tejido, hoja, semilla, material transformado, etc.);
• resultados deseados (rendimiento, pureza, tiempo que requiere la
purificación);
• uso posterior (PCR, clonación, etiquetado, transferencia, RT-PCR, síntesis
de ADNc, etc.).
Métodos de extraccion
• Para extraer los ácidos nucleicos del material biológico es preciso provocar una lisis celular, inactivar las
nucleasas celulares y separar los ácidos nucleicos de los restos de células. El procedimiento de lisis idóneo
suele consistir en un equilibrio de técnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el material inicial
complejo (un tejido, por ejemplo), pero suficientemente suave para preservar el ácido nucleico diana. Entre
los procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes:
• rotura mecánica (trituración, lisis hipotónica, etc.);
• tratamiento químico (detergentes, agentes caotrópicos, reducción con tioles,
etc.);
• digestión enzimática (Proteinasa K, etc.).
Métodos de purificación
• Los métodos empleados para purificar los ácidos nucleicos de
extractos celulares suelen ser combinaciones de dos o más técnicas
de las siguientes:
• extracción/precipitación;
• cromatografía;
• centrifugación;
• separación por afinidad.
Extracción/precipitación
• A menudo se efectúa una extracción con disolventes para eliminar los
contaminantes de los ácidos nucleicos. Por ejemplo, suele emplearse
una combinación de fenol y cloroformo con objeto de eliminar las
proteínas. Para concentrar los ácidos nucleicos suele realizarse una
precipitación con isopropanol o etanol.
Cromatografía:
• Pueden emplearse diversas técnicas cromatográficas de separación:
permeación sobre gel, intercambio iónico, adsorción selectiva o unión
por afinidad. La permeación sobre gel aprovecha las propiedades de
las partículas porosas del gel para tamizar moléculas. Se emplea una
matriz con poros de tamaño definido, que dejan pasar las moléculas
más pequeñas por difusión, pero no las más grandes, que quedan
eluidas en el volumen vacío. Así pues, las moléculas quedan eluidas
por orden de tamaño decreciente.
Centrifugación:
• La centrifugación selectiva constituye un método de purificación
eficaz. Así, por ejemplo, la ultracentrifugación en gradientes
autogenerados de CsCl con fuerzas g elevadas se lleva empleando
mucho tiempo para purificar plásmidos. La centrifugación suele
asociarse a otros métodos, como la cromatografía de columna
centrifugada, en cuyo caso se combina la permeación sobre gel y la
centrifugación para separar el ADN o ARN de contaminantes más
pequeños (sales, nucleótidos, etc.), intercambiar tampones o
seleccionar según el tamaño.
Separación por afinidad
• En los últimos años, cada vez son más los métodos de purificación que combinan la inmovilización
por afinidad de ácidos nucleicos y la separación magnética. Por ejemplo, los ARNm poli A +
pueden unirse a partículas magnéticas revestidas de estreptavidina mediante oligo dT marcados
con biotina, y el complejo de partículas puede eliminarse de la solución (y de los contaminantes
libres) con un imán. Esta técnica en fase sólida simplifica la purificación de los ácidos nucleicos,
pues permite sustituir las etapas de centrifugación, extracción orgánica y separación de fases por
una operación de separación magnética, única y rápida.
Método de extracción y purificación con CTAB
• El protocolo del método del bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB) fue
elaborado por Murray y Thompson en 1980 (Murray y Thompson, 1980) y
publicado posteriormente, en 1987, por Wagner y sus colaboradores (Wagner et
al., 1987). El método es adecuado para extraer y purificar ADN de vegetales y
alimentos derivados de vegetales y está especialmente indicado para eliminar los
polisacáridos y los compuestos polifenólicos, que, de otro modo, alterarían la
pureza del ADN y, por tanto, su calidad.
Principios de la cuantificación de ADN por
espectrofotometría
• El espectrofotómetro se funda en la transmisión de la luz a través de
una solución para determinar la concentración de un soluto presente
en la misma. El aparato funciona conforme a un principio sencillo: se
irradia una muestra con una radiación luminosa de longitud de onda
conocida y se mide la energía luminosa transmitida con una célula
fotoeléctrica situada detrás de la muestra.
Técnicas de hibridación:
¿Qué es?
• La hibridación es un proceso por el cual se combinan dos cadenas complementarias simples de
ácidos nucleicos (ADN o ARN) y se permite que formen una única molécula de doble cadena por
apareamiento de sus bases. Y el proceso inverso, una doble cadena de moléculas de ADN (o ARN
o ADN/ARN) puede ser calentada para romper el apareamiento de las bases y separar las dos
hebras. La hibridación es parte de muchas técnicas importantes en el laboratorio como la
reacción en cadena de la polimerasa y la hibridación de Southern.
Southern blot

• Southern blot, hibridación Southern o, simplemente, Southern es un

método de biología molecular que permite detectar la presencia de
una secuencia de ADN concreta en una mezcla compleja de este ácido
nucleico. Para ello, emplea la técnica de electroforesis en gel de
agarosa con el fin de separar los fragmentos de ADN de acuerdo a su
longitud y, después, una transferencia a una membrana en la cual se
efectúa la hibridación de la sonda.
Northern blot
• Northern blot, hibridación northern o ensayo northern es una técnica de detección de moléculas
de ácido ribonucleico (ARN) de una secuencia dada dentro de una mezcla compleja (por ejemplo,
un ARN mensajero para un péptido dado en una muestra de ARN total). Para ello, se toma la
mezcla de ARN y se somete a una electroforesis en gel a fin de separar los fragmentos de acuerdo
con su tamaño. Tras esto, se transfiere el contenido del gel, ya resuelto, a una membrana cargada
positivamente en la que se efectúa la hibridación de una sonda molecular marcada radiactiva o
químicamente.
Hibridación in situ
• Un desarrollo de las técnicas de preparación y fijación de materiales biológicos para su
observación al microscopio, junto con el desarrollo de técnicas de hibridación tipo Northern ha
llevado a poder realizar la hibridación de las sondas directamente sobre tejidos de material
orgánico. Utilizando técnicas inmunohistoquímicas se puede conocer la localización precisa de los
tejidos y células que están expresando los genes de secuencia complementaria a las sondas
utilizadas. También en esta categoría destaca el FISH, técnica de hibridación in situ, donde las
sondas son secuencias de ADN marcadas que se unen a secuencias de ADN conocidas dentro del
cromosoma, con las que comparte un alto grado de similitud y que podemos observar con un
microscopio óptico de fluorescencia.
Sonda molecular
• Una sonda es un fragmento de ADN (o raramente ARN) de pequeño tamaño (normalmente entre 100 y 1000
bases) usado en biología molecular como herramienta para detectar la presencia de secuencias
complementarias al ADN o ARN diana u objetivo.

• En su uso, la sonda se une a la secuencia diana monocatenaria (ADN1c ó ARN) mediante un mecanismo de
hibridación que forma una estructura bicatenaria, una de las hebras pertenece a la sonda, y la otra a la
secuencia diana. Esta unión se establece porque tanto la sonda como la diana tienen secuencias parcial o
totalmente complementarias en sus pares de bases .