TÉCNICAS GENÓMICAS

Utilidad/Objetivos:

1) Detección de microorganismos directamente en muestras clínicas identificando un

fragmento específico del genoma del microorganismo concreto

2) Cuantificación del número de virus presentes en muestras de sangre o suero: carga

vírica

3) Identificación de un microorganismo tras su aislamiento por métodos convencionales

(cultivo)

4) Detección de factores de virulencia

5) Determinación de determinantes de resistencia a los antimicrobianos directamente en

muestra o sobre las bacterias tras el cultivo

6) Estudios epidemiológicos mediante la comparación de las cepas aisladas.

Técnicas

Actualmente son muchas, variantes de las preexistentes o nuevas. En general se

clasifican en 2 tipos:

a) Técnicas de hibridación

b) Técnicas de amplificación

Premisas

•En cualquiera de ellas el primer paso es la EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS

NUCLEICOS que implica la lisis celular, la concentración de ácidos nucleicos, la
protección frente a la degradación enzimática y la inhibición de las reacciones que se
vayan a realizar. Se realiza por métodos físicos (sonicación, ciclos de
congelación/descongelación…), químicos (proteinasa K -sóla o asociada a tratamiento
con fenol/cloroformo- isotiocianato de guanidina…) y/o enzimáticos (lisozima…)
 •Cuando se calienta ADN por encima de 90ºC las 2 cadenas se separan →
desnaturalización. Al descender la temperatura las bases vuelven a aparearse
específicamente reconstituyéndose el ADN original

•Sonda: pequeños fragmentos de ADN (20-50 nucleótidos) sintetizados en el

laboratorio y cuya secuencia es complementaria de la de un fragmento genético, en este
caso, el que queremos detectar.

HIBRIDACIÓN

Es la unión de la sonda con su secuencia complementaria. Es una unión muy

específica, tanto que la diferencia en un solo nucleótido hace que no se produzca. Las
sondas se marcan (sustancia radiactiva, fluorescente o un enzima) para detectar la
producción de la hibridación. En la detección también pueden utilizarse anticuerpos
marcados frente a la cadena de ADN bicatenario.

La hibridación puede realizarse en solución, sobre un soporte sólido e “in situ”.

A) hibridación en solución: se realiza en un medio líquido. La hibridación se

produce rápidamente (1 hora o menos) por lo que es un método práctico y sencillo.
 HIBRIDACIÓN NEG HIBRIDACIÓN POS

1:introducción en el tubo del ADN extraido (en un solvente adecuado); 2:

desnaturalización mediante calor y se añade la sonda marcada por ejemplo con un ester de
acridina que es un marcador luminiscente; 3: al bajar la temperatura si hay
complementariedad la sonda hibrida (derecha); 4: se añade un alcali para crear el ambiente
adecuado para poder detectar la reacción; 5: en presencia de alcali se inhibe la
luminiscencia de las sondas no fijadas mientras que en las sondas hibridadas la acridina
queda protegida de la acción del alcali y emite luminiscencia

B) Hibridación sobre fase sólida. Tras la extracción de ácidos nucleicos y

desnaturalización del ADN “problema”, se deposita una gota en una membrana de nilon
o nitrocelulosa y se fija. Se sumerge en una solución de hibridación que contiene , entre
otras cosas, a la sonda. Tras eliminar la sonda no unida se detecta la fijada por dot blot o
spot blot según se deposite el material sobre la membrana como una gota circular o
alargada. Se utiliza fundamentalmente en investigación. En la práctica clínica existen
kits comerciales como (INNO-LIPA)

C) La hibridación “in situ” se realiza sobre un corte histológico.

 Tecnología de los chips o de los “arrays”

La traducción de “arrays” seria similar a “cepillos” genéticos por la similitud de las

sondas fijadas y las cerdas de un cepillo.

Sería una superficie generalmente de vidrio de aproximadamente 1 cm2 dividida en

numerosos cuadrados imaginarios en los que se fijan las sondas. Si las subáreas son
grandes (>200 μm) se habla de macroarrays y si son pequeñas (<200 μm) de
microarrays. La gran cantidad de sondas unidas y, por consiguiente, de posibles
detecciones hace que de considere a cada chip como un “laboratorio total”. Se utiliza
fundamentalmente en investigación.

TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN

La hibridación en ocasiones posee una baja sensibilidad debido a la presencia de un

escaso número de copias en la muestra original. Por ello en ocasiones como paso previo
se realiza una amplificación que no es más que una clonación in Vitro que permite
obtener múltiples copias de ADN. También puede realizarse sobre ARN tras su
conversión en ADN complementario (ADNc) mediante una transcriptasa inversa.

Técnicas

•Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): la secuencia diana del

microorganismo concreto se amplifica utilizando una polimerasa (habitualmente Taq
polimerasa) y cambios de temperatura

Permite "multiplicar" de forma exponencial el número de copias de de cualquier

fragmento de un ácido nucleico por medio de una simple reacción enzimática de
polimerización. La PCR es más conocida por las siglas de la terminología anglosajona
(Polimerase Chain Reaction), y en 1989 llegó a ser considerada el "mayor
descubrimiento científico del año".
 Fundamento: La PCR no es más que un proceso de clonación in vitro que
permite obtener múltiples copias de un fragmento de un ácido nucleico mediado por un
enzima (ADN polimerasa) y a partir de unas secuencias de iniciación se síntesis
(iniciadores, cebadores o primers), en presencia de deoxinucleótidos de las 4 bases e
iones Mg+, entre otros componentes y sometido a ciclos repetidos de
DESNATURALIZACION que se realiza a temperaturas superiores a 94ºC con lo que
se logra la ruptura de los puestes de hidrógeno y la separación de las cadenas,
APAREAMIENTO DE INICIADORES a las secuencias complementarias de la hebra
simple de ADN diana que se produce al disminuir la temperatura hasta 55-68ºC y
EXTENSION O SINTESIS a la T´óptima de actividad del enzima, que en el caso de la
Taq polimera son 72ºC.

Finalizado este paso de síntesis, el ciclo se repite entre 25-40 veces, actuando
los productos sintetizados como moldes para los siguientes ciclos, dando lugar a un
crecimiento exponencial del número de copias.

Por tanto, en una reacción de amplificación tenemos que considerar unos :

1) Parámetros o elementos químicos:

-ácido nucleico diana o molde, es decir el fragmento que se quiere amplificar y

detectar. En el caso que sea ADN se hace directamente la reacción de amplificación. Si
es ARN es necesario realizar un paso previo de retrotranscripción de ARN→ADN y a
partir de ahí realizar la PCR,

- secuencias de iniciación

- polimerasa (la más utilizada es la Taq polimerasa, una polimerasa termoestable

obtenida a partir de Termus aquaticus y que permitió la automatización del proceso).

dNTPs, Mg++

2) Parámetros o elementos físicos: la temperatura ya que en cada ciclo de

amplificación cambia en las tres fases: desnaturalización, apareamiento de iniciadores y
extensión o síntesis de nuevas cadenas
 Desnaturalización

Apareamiento

Extensión

•Nested PCR: Tras la amplificación de un fragmento se realiza una reamplificación

de un fragmento interno utilizando otros cebadores diferentes. Puede realizarse en un
tubo (utilizando temperaturas diferentes para ambos cebadores) o en dos tubos, uno para
la amplificación y otro para la reamplificación.

•PCR múltiple: a la muestra extraída se le añaden varios juegos de cebadores (cada

par específico de un microorganismo o región concreta). Al realizar la reacción, se
amplifican diferentes dianas. Por ejemplo puede realizarse para hacer una identificación
y detección de varios determinantes de resistencia a los antimicrobianos.

•PCR cuantitativa: Se utiliza para determinar el número de copias de la muestra

inicial. Suele utilizarse una técnica competitiva, para ello se incorpora a la reacción un
ARN o un ADN competidor –según el tipo de ácido nucleico diana a amplificar-, que
tenga la misma longitud y utilice los mismos cebadores que el ADN ó ARN problema.
La cantidad incorporada del competidor debe ser conocida, de forma que al final de la
reacción puedan determinarse las cantidades respectivas de amplicones producidos por
el problema y el competidor.
 Al ser las condiciones de la reacción idénticas, se produce una relación lineal
entre los cocientes iniciales y finales tanto del problema como del competidor, pudiendo
obtenerse de una forma sencilla la concentración inicial del ácido nucleico problema
(conocemos la concentración final del problema y tanto la inicial como la final del
competidor)

Cantidad conocida

ADN ó ARN ADN ó ARN

problema + competidor
¾ Mismos cebadores
¾ Igual longitud amplificados
¾ Mismas condiciones
Cantidad Cantidad
Ci Ci
= Relación lineal
Cf Cf

•PCR a tiempo real: se realiza en muy poco tiempo (aproximadamente 30

minutos) y proporciona una cuantificación continua y precisa del ADN que se va
formando. El fundamento es el mismo que el de la PCR convencional pero con algunas
modificaciones técnicas:

-Se realiza en un capilar por lo que los cambios de temperatura se realizan con
mucha rapidez

- Los fragmentos amplificados son más cortos

- Requiere un termociclador y lector específicos

- Se utilizan diferentes métodos de detección

•Amplificación basada en la transcripción: existen una gran variedad de técnicas:

NASBA, TMA, 3SR…

•Otras técnicas de amplificación