TEMA 4: HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

4.1.EL CONCEPTO DE HIBRIDACIÓN Y SU APLICACIÓN EN BIOLOGÍA

MOLECULAR
 La hibridación de ácidos nucleicos consiste en la unión de dos moléculas monocatenarias de
ácidos nucleicos, por la complementariedad de su secuencia de bases nitrogenadas,
originando una molécula híbrida bicatenaria.
 Las técnicas de hibridación permiten detectar secuencias concretas de ácidos nucleicos o
dianas (ADN o ARN) mediante el empleo de sondas marcadas.

*La secuencia diana es la secuencia concreta de bases nitrogenadas que se pretende detectar en la
muestra problema.
*La sonda es la cadena de nucleótidos cuya secuencia de bases nitrogenadas es complementaria a la
secuencia diana.

4.2. BASES TEÓRICAS DE LA HIBRIDACIÓN

4.2.1. Desnaturalización
 La desnaturalización es una propiedad del ADN consistente en la separación de las dos
cadenas de una molécula bicatenaria por la ruptura de los puentes de hidrógeno entre las
bases nitrogenadas complementarias.
 Se consigue aumentando la temperatura o aumentando el pH (pH alcalino).

CURVA DE FUSIÓN DEL ADN

 La curva de fusión es una curva de tipo sigmoide que se obtiene al medir la absorbancia a
260nm en función de la temperatura.
 Hay tres zonas:
- 1º zona (zona A): es un tramo recto sin pendiente. La temperatura en esta zona no alcanza
un valor suficiente para romper puentes de hidrógeno. El porcentaje de desnaturalización
de 0%.
- 2º zona (zona B): se produce la desnaturalización progresiva de la molécula.
 - 3º zona (zona C): una recta de pendiente prácticamente nula. Se mantiene desnaturalizado
al 100%.
TEMPERATURA DE FUSION
 La temperatura de fusión (Tm) es la temperatura a la cual la desnaturalización es del 50%.
 Para moléculas pequeñas, la Tm aumenta con la longitud.
 La Tm de las moléculas de gran tamaño esta directamente relacionada con el contenido de
pares GC: a mayor % de pares GC, mayor Tm.
 Tm deriva de temperatura melting.

4.2.2. Renaturalización
 La renaturalización es el proceso por el cual dos cadenas de una molécula de ADN
completamente separadas mediante desnaturalización térmica vuelven a reasociarse, al bajar
lentamente la temperatura, hasta formar la doble hélice original.

CINÉTICA DE RENATURALIZACIÓN
 Cuanto mayor sea la concentración, mayor será la probabilidad de que dos cadenas
complementarias se encuentren y, por lo tanto, mayor será la velocidad de renaturalización.
 Se produce en dos fases:
1º Fase de nucleación: es una fase lenta en la que secuencias cortas de bases
complementarias se aparean por formación de puentes de hidrógeno.
2º Fase de cierre de cremallera: es una fase rápida en la que se produce el cierre de las
secuencias vecinas originando la doble hélice.

4.2.3. Hibridación
 Las sondas reconocen regiones de ADN o ARN de secuencia única, por lo que la formación
del híbrido sonda/secuencia diana sigue una cinética de hibridación similar a la cinética de
renaturalización de moléculas bicatenarias de ADN de secuencias únicas.

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA HIBRIDACIÓN

 Fuerza iónica de la solución: cuanto mayor es la concentración de cationes monovalentes en
la solución, más energía en forma de calor hay que aportar al híbrido para desnaturalizarlo.
Esto se refleja en la curva de fusión, que se desplaza hacia la derecha cuando se aumenta la
concentración de cationes monovalentes, aumentando la Tm.
 Agentes desnaturalizantes: si se añaden estos compuestos al híbrido en solución, se requiere
menos energía para desnaturalizarlo, por lo que la curva de fusión se desplaza hacia la
izquierda y la Tm disminuye.
 Porcentaje de bases no complementarias: a mayor mismatch, menos Tm. La influencia del
mismatch en la Tm del híbrido es tanto mayor cuanto menor es la longitud de la sonda. Para
sondas de gran tamaño, la Tm del híbrido disminuye 1ºC por cada 1% de mismatch, pero
para sondas pequeñas una única base desapareada puede disminuir en varios grados la Tm
del híbrido.
4.3. LAS SONDAS
4.3.1. Características generales de las sondas
 La especificidad: es la capacidad que tiene una sonda para discriminar la secuencia diana con
la que se tiene que hibridar. El tamaño mínimo debe ser 16 bases.
 La sensibilidad: es la probabilidad de detectar cantidades mínimas del híbrido sonda-diana.
4.3.2. Tipos de sondas
 Sondas ADN.
 Sondas ARN.
 Sondas químicas sintéticas de ácidos nucleicos.

SONDAS DE ADN
 Según el proceso de obtención, las sondas de ADN pueden ser de:
o Síntesis química.
o ADN recombinante.
o PCR.

SONDAS DE ARN
 Las sondas de ARN pueden ser de:
o Síntesis química.
o Transcripción.

SONDAS QUÍMICAS SINTÉTICAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS

 Pueden ser:
o Sondas de ácidos nucleicos peptídico o PNA: El esqueleto típico de azúcar-
fosfato es sustituido por un esqueleto formado por unidades de aminoetil-glicina
unidas entre sí por enlaces amida.
o Sondas de ácidos nucleicos bloqueados: se modifica químicamente alguna de las
ribosas.
4.3.3. El marcaje de las sondas
TIPOS DE MARCADORES
 Marcadores que posibilitan la detección directa del híbrido: isotopos radiactivos y
fluorocromos.
 Marcadores que requieren métodos indirectos de revelado en varios pasos: haptenos.
1- ISOTOPOS RADIACTIVOS
 El marcaje radioactivo mediante autorradiografía. Los más utilizados son fósforo-32
y el tritio.
2- FLUOROCROMOS
 Se han utilizado derivados de la fluorescencia y la rodamina. Multitud de marcadores
fluorescentes: cianinas. Para la detección del híbrido marcado se necesita un
microscopio de fluorescencia.
3- HAPTENOS
  La detección del híbrido requiere métodos indirectos de revelado basados en la
afinidad química de moléculas o en métodos inmunológicos.

MÉTODOS DE MARCAJE
 Los más habituales son:
1º Desplazamiento de mella (Nick translation).
2º Cebado al azar o cebado aleatorio (random priming).
3º Marcaje terminal.
4º Marcaje por PCR.
5º Marcaje de sondas de ARN.
1º DESPLAZAMIENTO DE MELLA
 Contiene los siguientes elementos:
- ADNasa I.
- ADN polimerasa I bacteriana.
- Una mezcla de desoxirribonucleótidos trifosfato (uno de ellos está marcado).

 Procesos:
1º La ADNasa I rompe enlaces fosfodiéster entre dos nucleótidos consecutivos al azar en
ambas cadenas de la sonda. Es decir, produce mellas en sitios al azar en ambas cadenas.
2º La ADN polimerasa I intenta reparar las mellas. De esta manera, sustituye ADN sin
marcar por ADN marcado.
2º CEBADO AL AZAR O CEBADO ALEATORIO
 En este caso, la sonda se incuba con los siguientes reactivos:
- Una mezcla de todos los oligonucleótidos posibles de 6 bases(hexámeros).
- Fragmentos klenow de la ADN polimerasa I. Este fragmento conserva la actividad
polimerasa 5´-> 3´, pero carece de la actividad exonucleasa 3´-> 5´.
- Mezcla de desoxirribonucleótidos trifosfato, uno de ellos marcado.
 Fases:
1º Desnaturalización de la sonda.
2º Unión de los hexámeros a las cadenas de la sonda al azar.
3º Los hexámeros unidos a la sonda actúan como cebadores para que la ADN polimerasa
I (fragmento klenow) sintetice cadenas de ADN complementarias a la cadena que actúa
de molde, incorporando los desoxirribonucleótidos que hay en el medio de reacción, uno
de los cuales está marcado.
3º MARCAJE TERMINAL
 Se emplea la enzima desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT), una ADN polimerasa
capaz de incorporar desoxinucleótidos al extremo 3´-OH libre de una molécula de ADN sin
necesidad de una cadena molde. Esta enzima es capaz de incorporar todo tipo de nucleótidos
marcados.
4º MARCAJE POR PCR
  Se realiza en el mismo proceso de obtención de sondas de PCR, con marcadores radiactivos o
con haptenos, utilizando desoxinucleótidos marcados en la mezcla de PCR.
5º MARCAJE DE SONDAS DE ARN
 El marcaje se puede realizar en el mismo proceso de obtención de la sonda de ARN mediante
transcripción con una ARN polimerasa, añadiendo ribonucleótidos marcados a la mezcla de
reacción.

PURIFICACIÓN DE LA SONDA MARCADA

 La purificación de la sonda consiste en la eliminación de los nucleótidos libres marcados para
evitar ruido de fondo o interferencias en los resultados de las técnicas de hibridación.
 Los dos métodos mas usados para la purificación de las sondas son cromatográficos:
- La cromatografía de exclusión por tamaño.
- La cromatografía de adsorción.

4.4 FASES DE LA HIBRIDACIÓN

4.4.1. Fase de prehibridación
4.4.2. Fase de hibridación
4.4.3. Fase de posthibridación
4.4.4. Fase de detección del híbrido