SECUENCIACIN

Mtodo enzimtico de Sanger Este mtodo de secuenciacin de ADN fue diseado por Sanger, Nicklen y Coulson tambin en 1977 y se conoce como mtodo de los terminadores de cadena o dideoxi. Para este mtodo resulta esencial disponer de un ADN de cadena simple (molde) y un iniciador, cebador o "primer" complementario de una regin del ADN molde anterior a donde va a iniciarse la secuencia. Este cebador se utiliza como sustrato de la enzima ADN polimerasa I que va a extender la cadena copiando de forma complementaria el molde de ADN. El principio clave del mtodo de Sanger es el uso de didesoxinucletidos trifosfato (ddNTPs) como terminadores de la cadena de ADN. La muestra de ADN se divide en cuatro reacciones de secuenciacin separadas que contienen los cuatro desoxinucletidos estndar (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) y una ADN polimerasa. En cada reaccin se aade solo uno de los cuatro didesoxinucletidos (ddATP, ddGTP, ddCTP, o ddTTP). Estos didesoxinucletidos terminan la elongacin de la cadena al carecer un grupo 3'-OH que se necesita para la formacin del enlace fosfodister entre dos nucletidos durante la elongacin de la cadena de ADN. La incorporacin de un didesoxinucletido en la cadena naciente de ADN termina su extensin, lo que produce varios fragmentos de ADN de longitud variable. Los didesoxinucletidos se aaden a concentraciones lo suficientemente bajas como para que produzcan todas las posibilidades de fragmentos y al mismo tiempo sean suficientes para realizar la secuenciacin. Los fragmentos de ADN sintetizados y separados por tamao (con una resolucin de un solo nucletido) mediante electroforesis. Cada una de las cuatro reacciones de sntesis se corre en carriles individuales (Carril A, T, G y C) y se visualizan las bandas de ADN mediante autoradiografa. Secuenciacin automtica empleando el metodo enzimtico Es una alternativa al mtodo de Sanger. Consiste en marcar el oligo cebador, los nucletidos o los terminadores con un compuesto fluorescente y activar la reaccin de secuenciacin. Los productos de la reaccin se detectan directamente durante la electroforesis al pasar por delante de un lser que al excitar los fluorforos permite detectar la fluorescencia emitida.

Secuenciacin empleando nucletidos fluorescentes: Se realizan cuatro reacciones de secuenciacin distintas en cada una de las cuales se aade un ddNTP diferente en cada una de ellas. En todas se aaden los cuatro nucletidos marcados. Secuenciacin empleando cebadores fluorescentes: Se realizan cuatro reacciones de secuenciacin distintas en cada una de las cuales se aade el oligonucletido o cebador marcado con una

sonda fluorescente distinta y un ddNTP diferente en cada una de ellas. Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en un nico tubo. Secuenciacin empleando terminadores fluorescentes: Se realiza una nica reaccin de secuencia en presencia de los cuatro ddNTPs, cada uno de ellos marcados con una sonda fluorescente distinta.