Universidad Autónoma de Baja California

Facultad de Medicina y Psicología

Médico 2010-1

Clase de Microbiología Molecular

QFB. Jonathan López Baena

Técnica de Northern Blot

Presenta: Manuel Diaz Nava

Grupo: 822

Tijuana B.C a 29 de junio de 2022

 Técnica de Northern Blot
Introducción y fundamento de la técnica
La practica medica actualmente requiere el uso de técnicas de biología molecular
para el diagnóstico, hallazgo de genes específicos y expresión génica, esto debido
a que los resultados que este tipo de técnicas ofrecen frente a las técnicas
tradicionales como la serología, cultivos de microbiología, tinciones o pruebas
bioquímicas. Además de que las técnicas de biología molecular permiten el hallazgo
de algún gen o microrganismo, tambien permite hacer una identificación de genotipo
de una manera mas especifica y confiable, lo cual permite saber las características
fenotípicas y el tratamiento mas adecuado ya sea para microorganismos infecciosos
o expresión génica tumoral.
La técnica de Northern Blot consiste en la detección de moléculas de ARN,
siendo la secuencia propiamente dicha, secuencias promotoras, con el fin de
determinar su peso en pares de bases y determinar si existe la presencia de un gen
en específico. Esto se hace por medio de la separación de las secuencias de ARN
por medio de la electroforesis para su visualización con una secuencia control y
determinación del peso molecular en función de su avance en el gel.
Utilidad
La técnica de Western Blot tiene diversas aplicaciones en el área médica, como la
búsqueda de expresión de genes, protooncogenes, genes supresores de tumores,
genomas virales y bacterianos; esto con el fin de determinar un diagnóstico de
manera específica basándose en el genoma. Dentro del área de microbiología
permite encontrar la expresión de genes de virulencia, resistencia a antibióticos y
antígenos específicos para determinar el genotipo del microorganismo y por lo tanto
dar un tratamiento mas especifico y dirigido contra el agente patógeno, en lugar de
administrar quimioterapia antibacteriana o antiviral de manera empírica y por lo tanto
disminuir el riesgo de la aparición de resistencias.
Técnica de realización
Extracción de ARN
Debido a la fragilidad del ARN, es necesaria la eliminación de la ARNsas, las cuales
son resistentes al calor, tienen un amplio rango de pH, no requieren cofactores y
mantienen su actividad después de cierto tiempo de calentamiento. Para ello se
procede a congelar el tejido o muestra obtenida, y a mezclar con la solución
desnaturalizante de sales de guanidinio, igualmente es importante el uso de guantes
por el riesgo de contaminación con ARNasas por parte de quien realiza la técnica,
este paso debe ser realizado en el menor tiempo posible.
Separación del ARN
Existen dos procedimientos para logar la separación del ARN obtenido, los cuales
es la ultra centrifugación en gradiente de densidad y la extracción fenólica.
El método de ultra centrifugación se basa en la mayor densidad que presenta
el ARN en comparación con otros componentes celulares; inicialmente las células
son sometidas a lisis por un triturador con solución 4M GTC, después se centrifuga
en un gradiente de cloruro de cesio. Finalmente se decanta el sobrenadante y el
ARN se purifica con etanol y centrifugación.
El método de extracción fenólica es mas utilizado y se basa en la mayor
solubilidad de los ácidos nucleicos en soluciones acuosas que en solventes
orgánicos. Se realiza la lisis de las células por un triturados y se añade fenol, dando
lugar a una fase inferior orgánica y una fase superior acuosa, siendo la segunda en
donde se encuentra el ARN a analizar. Posteriormente la fase acuosa es separada
y se le añada etanol y se le centrifuga para causar la precipitación del ARN.
Electroforesis
El ARN purificado debe ser colocado en pozos de un gel de agarosa/formaldehido
en cantidades de 5 y 20 µg, el cual debe tener agua con dietilpirocarbonato al 1%
durante algunas horas para la eliminación de ARNasas residuales, debido a la
toxicidad del DEPC y el formaldehido es necesario trabajar bajo campana de
extracción de gases. Una vez colocado el ARN se debe colocar solución buffer,
bromuro de etidio, glicerol y sacarosa. Posteriormente se pone a corre el gel durante
las horas que sea necesario a un voltaje de 40 a 50 voltios.
Transferencia e inmovilización del ARN
Una vez realizado el proceso de electroforesis, el gel corrido debe transferirse a una
membrana de Nylon cargada positivamente y observar si hubo transferencia del
ARN al teñir la membrana con azul de metileno para la observación de bandas y
debe lavarse con agua destilada.
Hibridación
La membrana debe lavarse con agua destilada y debe ser calentada a 65°C,
posteriormente debe añadirse solución buffer e incubar en un intervalo de 55 a 65°C.
Interpretación
Observar las bandas presentes en la membrana observando su avance que fue en
función de su paso molecular en pares de bases, comparando los resultados con
un control, con el fin de saber si un gen ha sido o no expresado.
Ventajas
Es una técnica con alta sensibilidad y permite detectar secuencias especificas
expresadas por microorganismos o células eucariotas. En el uso de
quimioluminiscencia es mas seguro, da una vida útil mas prolongada al ARN y se
requieren menores tiempos de exposición en comparación con el uso de marcaje
radioactivo.
Desventajas
La técnica debe ser realizada rápidamente para evitar contaminación por ARNasas
ambientales o propias de la muestra y los reactivos utilizados son tóxicos y se deben
extremar precauciones para reducir el riesgo de intoxicación y tiempo de exposición.
 Referencias
Campillo, N. (2015). Estandarización de un protocolo para Northern blot no
radioactivo usado en la detección de pequeños RNA en células Vero. Rev.
Colomb. Biotecnol, 17(2), 123-128.
Diz, O. (2020). Técnicas de biología molecular en el diagnóstico de enfermedades
infecciosas. NPunto, 3(30), 88-111.
Hernández, A. (1995). Análisis del RNA: Estudio de la expresión génica. Nefrología,
15(2), 67-84.
NIH. (2022). Northern Blot. Recuperado el 29 de junio de 2022, de National Human
Genome Research Institute Sitio web: https://www.genome.gov/es/genetics-
glossary/Northern-blot