GUÍA DE APRENDIZAJE

SEMANA N° 14

CURSO: BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR

DOCENTE: ROMEL IVAN GUEVARA GUERRERO

Jaén – Perú, noviembre 2021

 Escuela Profesional de Tecnología Médica
Carrera Profesional de Tecnología Médica

ÍNDICE

Pág.
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................... 3

2. CONTENIDO TEMÁTICO ................................................................................................................. 3

3. DESARROLLO ................................................................................................................................... 3

3.1. Hibridación de ácidos nucleicos .................................................................................................... 3

3.2. Síntesis química de ADN.............................................................................................................. 5

4. ACTIVIDADES Y EVALUACIÓN ..................................................................................................... 7

Actividad 1 .............................................................................................................................................. 7

Evaluación de la Actividad 1 .................................................................................................................... 7

5. GLOSARIO ......................................................................................................................................... 8

6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................................. 8

SEMANA N° 14 – BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR 2

 Escuela Profesional de Tecnología Médica
Carrera Profesional de Tecnología Médica

1. INTRODUCCIÓN

Los ácidos nucleicos se pueden utilizar en el diagnostico de enfermedades infeccionas o de tipo genómico
mediante técnicas que permiten identificar los ácidos nucleicos involucrados en la enfermedad. Estas técnicas
poseen un elevado nivel de sensibilidad y especificidad y en principio deberían ser habituales en los centros
de salud, sim embargo son metodologías que se han ido desarrollando en los últimos años y su tecnología
todavía cuenta con costo elevados y procedimientos que requieren profesionales especializados, no obstante
es importante que un profesional en ciencias de la salud cuente con los conocimientos básicos al respecto ya
que en un futuro próximo, cualquier estudiante con los que ahora cuenta la UNJ mas adelante llegue a ser un
profesional que le toque trabajar en centros especializados que utilicen estas técnicas. Sin ir muy lejos hoy en
día son pocos los lugares donde se hacen pruebas moleculares para diagnosticar la COVID-19.

2. CONTENIDO TEMÁTICO

- Hibridación de ácidos nucleicos

- Síntesis química de ADN

3. DESARROLLO

3.1. Hibridación de ácidos nucleicos

La hibridación de ácido nucleico comprende varias técnicas relacionadas que se basan en la observación de
que dos moléculas de ácido nucleico de cadena sencilla con secuencia de bases complementaria pueden formar
un híbrido de doble cadena. Suponga, por ejemplo, una situación en la que se tiene una mezcla de cientos de
fragmentos de DNA de longitud y composición general de bases idénticas que sólo difieren unos de los otros
por su secuencia de bases. Por ejemplo, asúmase que uno de los fragmentos de DNA constituye una porción
del gen para la insulina y el resto contiene genes no relacionados. La única manera de distinguir entre el
fragmento que codifica el polipéptido insulina y todos los demás es realizar un experimento de hibridación
molecular con moléculas complementarias como sondas.
En el ejemplo dado, la incubación de la mezcla de fragmentos de DNA desnaturalizados con una cantidad
excesiva de mRNA para insulina llevaría a los fragmentos de ADN de insulina a formar híbridos DNA-RNA
bicatenarios, mientras los demás fragmentos de DNA son monocatenarios. Los híbridos DNA-RNA podrían
separarse de los fragmentos de cadenas sencillas en varias formas. Por ejemplo, la mezcla podría pasarse por
una columna de hidroxiapatita bajo condiciones iónicas en las que los híbridos se unieran con las sales de
fosfato de calcio de la columna, mientras que las moléculas de DNA sin hibridar pasarían sin unirse. Entonces
los híbridos de la columna podrían liberarse mediante el incremento en la concentración del amortiguador de
lavado. Los experimentos que usan hibridación de ácidos nucleicos requieren la incubación de dos poblaciones
de ácidos nucleicos complementarios de cadena sencilla en condiciones (fuerza iónica, temperatura, etc.) que
SEMANA N° 14 – BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR 3
 Escuela Profesional de Tecnología Médica
Carrera Profesional de Tecnología Médica

promuevan la formación de moléculas de cadena doble. Según el tipo de experimento realizado, las dos
poblaciones de moléculas en reacción podrían estar presentes en solución, o una población podría
inmovilizarse, por ejemplo, por la localización dentro de un cromosoma (como en la figura 1).

Figura 1. Hibridación in situ. En la figura superior se

observan los pasos de una hibridación convencional, mientras
que en la parte inferior se muestra la metafase de células de un
paciente hibridadas con una sonda diseñada para la parte
terminal del cromosoma 4q. Puesto que sólo hay una señal
verde, se confirma que en uno de los cromosomas 4 falta
material del extremo terminal del brazo q. Este caso es un buen
ejemplo de cómo combinando la citogenética de rutina con la
FISH se pueden diagnosticar con exactitud anomalías
cromosómicas sutiles. Tomado de Karp G. Biología Celular y
Molecular. 6a ed. México DF: McGraw-Hill Interamericana
Editores; 2011. 842 p. y
http://www3.uah.es/biomodel/citogene/dynacare/metafish.htm

En muchos casos una de las poblaciones de ácidos nucleicos de cadena sencilla que se emplea en el
experimento de hibridación se encuentra dentro de un gel. Considérese una población de fragmentos de DNA
que se prepararon a partir de DNA genómico y se fraccionaron por electroforesis en gel. Para llevar a cabo la
hibridación, el gel se trata a fin de hacer al DNA monocatenario; éste se transfiere entonces del gel a una
membrana de nitrocelulosa y se fija en la membrana por calentamiento a 80°C en vacío. El procedimiento por
el que se transfiere DNA a la membrana se denomina transferencia (manchado o blotting). Una vez que el
DNA se une, la membrana se incuba con una sonda de DNA (o RNA) de cadena sencilla y con marca radiactiva
capaz de formar híbridos con un grupo complementario de fragmentos. Luego la radiactividad libre se elimina
y la localización de la sonda unida se determina por autorradiografía, como se muestra en la figura 2. El
experimento recién descrito mostrado en dicha figura se conoce como método Southern (en honor de Edwin
Southern, su creador). Con el método de transferencia de Southern pueden identificarse uno o unos cuantos
fragmentos de restricción de DNA que contienen una secuencia particular de nucleótidos, aun si el gel contiene
miles de fragmentos no relacionados. Las moléculas de RNA también pueden separarse por electroforesis e
identificarse con una sonda marcada de DNA después de transferirse a una membrana, este procedimiento, se

SEMANA N° 14 – BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR 4

 Escuela Profesional de Tecnología Médica
Carrera Profesional de Tecnología Médica

denomina método Northern. Las sondas de DNA pueden etiquetarse de varias maneras. Una sonda radiactiva
incorpora un isótopo radiactivo (como 32P) en uno o más sitios de la molécula. La presencia de la sonda se
detecta por autorradiografía. Las sondas también pueden etiquetarse con fluoróforos y detectarse por
fluorescencia. Otra etiqueta de uso común es la biotina, una molécula orgánica pequeña que puede unirse de
manera covalente al esqueleto de DNA. La biotina es detectada por la proteína avidina (o por estreptavidina),
que se une a ella con fuerza. La avidina misma debe marcarse para la detección, por ejemplo, con un fluoróforo
como se muestra en la Figura 1. La hibridación de ácido nucleico también puede proporcionar una medida de
la similitud en la secuencia de nucleótidos entre dos muestras de DNA, como podría obtenerse de dos
organismos distintos, por ejemplo. Entre más distante sea la semejanza entre dos especies, mayor es la
divergencia en sus secuencias de DNA. Si los DNA purificados de las especies A y B se mezclan juntos, se
desnaturalizan y se permite que formen hélices de nuevo, un porcentaje de las cadenas dobles de DNA se
forman con cadenas de DNA de las dos especies. Como contienen bases discrepantes, estas cadenas dobles
son menos estables que las formadas con cadenas de DNA de la misma especie y la inestabilidad se refleja en
la menor temperatura en la que se disuelven. Cuando se permite que DNA de distintas especies formen de
nuevo hélices dobles en diferentes combinaciones, la temperatura de fusión (Tm) de las cadenas dobles
híbridas proporciona una medida de cuanto difieren los organismos.

Figura 2. Sourthen blot. Se muestra la secuencia de pasos para realizar una transferencia de ADN. Tomado de Karp G.
Biología Celular y Molecular. 6a ed. México DF: McGraw-Hill Interamericana Editores; 2011. 842 p.

3.2. Síntesis química de ADN

Si se conocen las secuencias de nucleótidos en los extremos de una región de ADN particular, el fragmento
intermedio puede amplificarse directamente mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). A
continuación, se describe la técnica básica de PCR y tres situaciones en las que se utiliza.

SEMANA N° 14 – BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR 5

 Escuela Profesional de Tecnología Médica
Carrera Profesional de Tecnología Médica

La PCR depende de la capacidad para desnaturalizar (fundir o separar las cadenas) alternativamente moléculas
de ADN de doble hebra e hibridar hebras simples complementarias de forma controlada. Como se muestra en
la Figura 3, un procedimiento de PCR típico comienza con la desnaturalización por calor de una muestra de
ADN en hebras simples a 95°C. A continuación, se añaden grandes cantidades de dos oligonucleótidos
sintéticos complementarios a los extremos 3' del segmento de ADN de interés (la secuencia diana) que servirán
como cebadores o primers para que pueda actuar la ADN polimerasa y la temperatura se reduce a 50-60°C.
Estos oligonucleótidos específicos, que están presentes en una concentración muy alta, se hibridan con sus
secuencias complementarias en la muestra de ADN, mientras que las cadenas largas del ADN de la muestra
permanecen separadas debido a su concentración comparativamente baja. Los oligonucleótidos hibridados
luego sirven como cebadores para la síntesis de la cadena de ADN en presencia de desoxinucleótidos (dNTP)
y una ADN polimerasa resistente a la temperatura como la de Thermus aquaticus, una bacteria que vive en
fuentes termales. Esta enzima, llamada polimerasa Taq, puede permanecer activa incluso después de calentarse
a 95 ° C y puede extender los cebadores a temperaturas de hasta 72 ° C. Cuando se completa la síntesis, toda
la mezcla se recalienta a 95 ° C para desnaturalizar los dúplex de ADN recién formados. Después de que la
temperatura se vuelve a bajar, tiene lugar otro ciclo de síntesis porque todavía hay un exceso de cebador. Los
ciclos repetidos de desnaturalización (calentamiento) seguidos de hibridación y síntesis (enfriamiento)
amplifican rápidamente la secuencia de interés. En cada ciclo, el número de copias de la secuencia entre los
sitios del cebador se duplica; por lo tanto, la secuencia diana aumenta exponencialmente, aproximadamente 1
millón de veces después de 20 ciclos, mientras que todas las demás secuencias en la muestra de ADN original
permanecen sin amplificar.

Desnaturalización

Las cadenas se separan

Muestra de ADN Primers Nucleótidos

Hibridación

Los primers se unen

Taq polimerasa Mix buffer Tubo de PCR

Elongación

Síntesis de la nueva cadena

Ciclo de PCR

Termociclador

Figura 3. Reacción en cadena de la polimerasa. Tomado de https://www.biomadam.com/types-of-pcr

SEMANA N° 14 – BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR 6

 Escuela Profesional de Tecnología Médica
Carrera Profesional de Tecnología Médica

Una variación del método de PCR permite la amplificación por PCR de una secuencia de ADN
complementario (ADNc) sintetizado a partir de una molécula de ARN. Este método, conocido como
transcriptasa inversa-PCR (RT-PCR), comienza con el aislamiento del ARN para luego por medio de una
enzima llamada transcriptasa inversa se sintetiza la cadena de ADNc y esta sirve como molde para la PCR.
Otra variación de PCR que usualmente está asociado a la RT-PCR es la PCR cuantitativa (qPCR) o también
llamada PCR en tiempo real (RT-PCR), hay que percatarse que esta última abreviatura es similar a la PRC con
transcriptasa inversa por lo que cuando se aprecia esta abreviatura hay que entender que podrían estar
refiriéndose a la primera o la segunda o ambas técnicas que estan muy relacionadas y muy amenudo se utlizan
juntas como es el caso de las pruebas moleculares que detectan el virus que causa la COVID-19, en la que se
purifica el ARN viral para luego sintetizar a partir de este al ADNc el cual servirá como molde para una PCR
que cuantifica por medio de fluorescencia la cantidad de ADN producida en cada ciclo y por tanto se cuantidica
la cantidad de ARN inicial del virus si es que estuviera presente en la muestra. También se puede realizar de
para medir con precisión la cantidad inicial de un ARNm celular particular. Para llevar a cabo la qPCR, la
cantidad de secuencia de ADN bicatenario producida por cada ciclo de amplificación se determina a medida
que avanza la amplificación de una secuencia de ARNm particular. Por extrapolación de estas cantidades, se
puede obtener una estimación de la cantidad inicial de la secuencia de ARNm.

4. ACTIVIDADES Y EVALUACIÓN

Actividad 1

Explique el fundamento del diagnóstico molecular de una infección por SARS-CoV-2

Evaluación de la Actividad 1

El alumno debe presentar su trabajo en con un contenido máximo de una página en formato digital (word, pdf,
etc) colocando como nombre al archivo únicamente sus apellidos. En caso de no contar con acceso a un
ordenador, podrá escribir sobre una hoja de papel y enviar la foto teniendo en cuenta que es responsabilidad
del estudiante que el contenido escrito sea legible. Se calificará de acuerdo a la rúbrica siguiente rúbrica:
RÚBRICA

CALIFICACIÓN
Muy Muy
Categoría Deficiente Regular Bueno Calificación
deficiente bueno
(2) (3) (4) parcial
(1) (5)
Síntesis: Capacidad para
expresar lo deseado usando la
menor cantidad de palabras
posibles (x0.4).
Redacción: Coherencia y
claridad al expresar lo

7
deseado (x0.8).

SEMANA N° 14 – BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR

 Escuela Profesional de Tecnología Médica
Carrera Profesional de Tecnología Médica

Precisión: La redacción
guarda relación con los temas
de la guía de aprendizaje
(x1.2).
Presentación: Buena
presentación, limpieza y sin
faltas ortográficas (x0.4).
Originalidad: Índice de
similitud baja que demuestre
que el trabajo es de redacción
propia. (x1.2).
Calificación final

5. GLOSARIO

Fragmento de restricción: Fragmentos de ADN que se producen como consecuencia de la digestión de una
muestra de ADN con enzimas que cortan el ADN llamadas endonucleasas de restricción.
Sonda: Fragmento de ADN con secuencia conocida y se utiliza para que se una (hibridar) con una secuencia
de ADN o ARN específico.

6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Karp G. Biología Celular y Molecular. 6a ed. México DF: McGraw-Hill Interamericana Editores; 2011.
842 p.
2. Lodish H, Berk A, Kaiser CA, Krieger M, Bretscher A, Ploegh H, et al. Molecular Cell Biology. 8th
ed. New York, USA: W. H. Freeman and Company; 2016. 1278 p.

SEMANA N° 14 – BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR 8