Actividad Biología Molecular

Nombre: Karina Araya

Carrera: Laboratorio Clínico y Bco de Sangre.

PCR

¿Qué es?
El PCR (reacción en cadena de la polimerasa) es una técnica que se utiliza para
amplificar un fragmento de ADN, lo que permite identificar microorganismos (MO)
patógenos con mayor facilidad, mediante procesos in vitro, mediados por enzimas que
generan copias ilimitadas de un determinado segmento de ADN.

¿Qué detecta?
Se utiliza para la detección y amplificación de ARN. Permite estudiar la expresión
de determinados genes (su traducción a proteínas). También sirve para detectar la presencia
de virus (como el virus del sarampión, hepatitis b y c, VPH) y el análisis citogenético
molecular de translocaciones cromosómicas. Además se aplica en el análisis de DNA de
diversos organismos.
Además, se aplica en el diagnóstico de: Escherichia coli, otras enterobacterias,
Pseudomonas aeruginosa, estafilococos, enterococos, Campylobacter spp. Mycobacterium
spp., agentes causales de la meningitis bacteriana, de las infecciones genitourinarias, de la
neumonía, de otitis media. Asimismo, la PCR múltiple también ha resultado una
herramienta muy útil en la identificación del agente etiológico en casos de úlceras genitales
y de sífilis.
Esta técnica se puede usar, por ejemplo, para detectar la expresión proteica de
antígeno específico prostático en células (detección de micrometástasis o células tumorales
circulantes).

¿Qué utilidad clínica tiene?

Es utilizada como medio de diagnóstico, para identificar diversas patologías,
procedentes de virus, bacterias, mutaciones de ADN (enfermedades hereditarias presentes
en el genoma).
 Es considerada la técnica más sensible y la que mejor se aplica microbiología
clínica. En particular, en el caso de patógenos que son difíciles de crecer in vitro o que
presentan un crecimiento lento, así como en el de todas aquellas infecciones clínicamente
atribuibles a diferentes agentes, la PCR ha aportado un gran valor diagnóstico.
Se usa, además, como mecanismo de prevención rutinaria en los donantes de sangre,
pudiendo detectar, por ejemplo, VIH o Hepatitis B.

¿Ventajas y desventajas?
Ventajas

I. Rapidez y sencillez de uso. permite clonar ADN en pocas horas, utilizando

equipos relativamente poco sofisticados. Una reacción de PCR típica consiste en
30 ciclos de desnaturalización, síntesis y reasociación. Cada ciclo dura
típicamente de 3 a 5 minutos y se utiliza un termociclador que lleva un
microprocesador para programar los cambios de temperaturas y el número de
ciclos deseado.

II. Sensibilidad. puede amplificar secuencias a partir de cantidades ínfimas de

ADN, incluso a partir de ADN contenido en una sola célula. Esta elevada
sensibilidad ha permitido el desarrollo de nuevos métodos para el estudio de la
patogénesis molecular y la aparición de numerosas aplicaciones (ciencia
forense, diagnóstico, estudios de paleontología molecular, etc) donde las
muestras pueden contener muy pocas células.

III. III. Robustez. permite la amplificación de secuencias específicas de material

que contiene ADN muy degradado, por lo que resulta adecuado para estudios de
antropología y paleontología molecular, por ejemplo para el análisis de ADN
recuperado de individuos momificados o muestras fósiles.

Desventajas
I. Necesidad de disponer de información sobre la secuencia del ADN diana,
para poder construir oligonucleótidos específicos que actúen como cebadores
para la amplificación selectiva de una secuencia particular de ADN se necesita
disponer de alguna información previa sobre la propia secuencia a amplificar.

II. Tamaño corto de los productos de la PCR Los fragmentos pequeños se

amplifican muy fácilmente, pero conforme aumenta su tamaño se hace más
 difícil obtener una amplificación eficiente. En la actualidad, sin embargo ya es
posible amplificar secuencias por PCR de tamaños entre 20 y 40 Kb.

III. Infidelidad en la replicación del ADN En el caso de que el ADN se replique in

vitro la tasa de errores cometidos durante el copiado se dispara. Sin embargo, la
clonación del ADN in vivo, presenta mecanismos de lectura y corrección de
errores.

IV. Peligro de contaminación La facilidad con que se amplifica el ADN exige

evitar el peligro de contaminación inherente al poder multiplicador de la
reacción. Para evitar contaminaciones, se deben tomar las muestras bajo
condiciones de esterilidad, separación estricta de áreas dentro del laboratorio, uso
de reactivos y materiales específicamente destinadas a PCR.

Electroforesis en gel de agarosa

¿Qué es?
La electroforesis en gel es un método que se usa para separar macromoléculas
fragmentos de ADN u otras macromoléculas, en función del tamaño, la carga eléctrica y
otras propiedades físicas.
El término electroforesis describe la migración de las partículas cargadas bajo la
influencia de un campo eléctrico. «Electro» se refiere a la electricidad y «foresis», del
griego phoros, significa «trasladar». Por lo tanto, la electroforesis en gel es una técnica que
consistente en aplicar corriente eléctrica a las moléculas para que atraviesen una placa de
gel.

¿Qué detecta?
Principalmente, detecta fragmentos de ADN (nos permite ver cuántos fragmentos de
ADN están presentes en una muestra y qué tan grandes son unos respecto a otros, además,
también se puede determinar el tamaño absoluto de dicho fragmento, examinándolo según
una escala estándar), ARN y proteínas.

¿Qué utilidad clínica tiene?

En el laboratorio clínico, la aplicación más relevante de la electroforesis es la
separación de proteínas presentes en el suero, orina y otros fluidos biológicos como el
líquido cefalorraquídeo y el líquido sinovial. También se puede usar para corroborar un
PCR por medio de la visualización de los fragmentos de ADN.
Se aplica en la detección de enfermedades infecciosas (enfermedad de Chagas,
tuberculosis, lepra, VIH, entre otras), así como la determinación de metabolitos
farmacéuticos (que pueden inducir daño orgánico, por ejemplo del riñón), de fármacos
(metanfetaminas) y esteroides (testosterona) en orina.
Esta técnica tiene importancia para el diagnóstico de algunas enfermedades
hereditarias. El cambio de un nucleótido en el genoma puede indicar la presencia de alguna
patología. Así también se usa en medicina forense, para identificar agresores sexuales,
asesinos y restos humanos encontrados en accidentes.

¿Ventajas y desventajas?

Ventajas
Algunas ventajas que presenta es uso de geles consiste en que no presentan
fenómenos de adsorción, se requiere poca cantidad de muestra y presenta una mejor
visualización y resolución (superando la débil resolución del acetato de celulosa).
El gel es fácilmente vertido, no desnaturaliza las muestras, y estas pueden ser
recuperadas. La agarosa presenta una buena resolución y se usa para la separación de
moléculas grandes con r > 5-10nm (virus, ácidos nucleicos, lipoproteínas).

Desventajas
Algunos de los componentes utilizados en las técnicas de electroforesis de ADN son
tóxicos y deben tomarse precauciones especiales en su manejo. El bromuro de etidio es
tóxico a elevadas concentraciones debido a su capacidad mutagénica. Se debe evitar la
inhalación del compuesto en estado sólido (manipularlo en campana de extracción), y se
deben manejar las soluciones siempre con guantes.
La acrilamida en polvo y en solución también es tóxica, y tiene la capacidad de penetrar a
través de la piel. Se debe evitar la inhalación del compuesto en estado sólido (manipularla
en campana de extracción), y manejar las soluciones siempre con guantes. Sin embargo,
una vez polimerizada los geles ya no resultan tóxicos.
Microarrays o Chip de ADN

¿Qué es?
El microarray o chip de ADN consiste en una superficie (generalmente de vidrio) a
la que se unen fragmentos de ADN por hibridación con sondas específicas. Estos
instrumentos se utilizan para determinar la expresión diferencial de genes en diversas
circunstancias, por ejemplo, en presencia o ausencia de una enfermedad.

¿Qué detecta?
Permite detectar variaciones genéticas analizando los niveles de expresión de un
gen. Una muestra que contiene ADN o ARN, se pone en contacto con el chip. El
acoplamiento entre la muestra y las secuencias de genes en el chip produce una cantidad de
luz que se puede medir. Las áreas que producen luz identifican los genes que se expresan
en esa muestra.

¿Qué utilidad clínica tiene?

Se usan para identificar genes con una expresión diferencial en condiciones

distintas, por ejemplo, comprando genes que producen enfermedades con genes de células
sanas. También se utiliza en la clasificación molecular en enfermedades complejas, en la
identificación de genes característicos de una patología, en la predicción de respuesta a un
tratamiento y selección de mutaciones y polimorfismos de un único gen (SNP).

¿Ventajas y desventajas?

Ventajas
• Económicos
• Flexibilidad en el diseño experimental
• Elevada intensidad de señal (secs largas)
Desventajas
• Baja Reproducibilidad
• Hibridación cruzada (baja especificidad)
• Elevada manipulación manual (Posibilidad de contaminación)

Southern Blot

¿Qué es?
Corresponde a una técnica de análisis de genética molecular que permite detectar
diferencias en la longitud de los fragmentos de ADN tras ser digeridos por enzimas. Tras esto, se
realiza una electroforesis en gel de agarosa para separar los diversos fragmentos de ADN según su
tamaño. Luego, se baña en gel en un tratamiento alcalino, generalmente hidróxido de sodio
(NaOH). Lo que permite separar la doble hebra y eliminar los restos de ARN que podrían quedar.

¿Qué detecta?
Permite detectar una secuencia específica de ADN en una mezcla compleja de ácido nucleico.

¿Qué utilidad clínica tiene?

El Southern Blot es una técnica que puede proveer información que puede ser usada
para el diagnóstico molecular de algunas enfermedades génicas, ejemplo de ellas serían el
Síndrome de Angelman, Síndrome de Prader-Willi y Síndrome X frágil.

¿Ventajas y desventajas?

Ventaja
Consiste en su alta especificidad y reproducibilidad permitiendo la valoración del
estado físico del ADN, y así poder valorar con precisión si el ADN viral está integrado en
el genoma del huésped o permanece como episoma en el huésped. También puede detectar
pérdidas homocigóticas.
Desventajas
La desventaja de esta técnica es que es de larga duración y requiere de personal
entrenado. Además, necesita de una cantidad relativamente alta de ADN, lo que permite
estudiar una pequeña zona del genoma con cada sonda y la mayoría de las sondas son poco
informativas (heterocigosidad baja).

Western Blot

¿Qué es?
El Western blot (inmunoblot o electrotransferencia), corresponde a una técnica que
se utiliza en biología celular y molecular con la finalidad de identificar proteínas
especificas en una mezcla compleja de proteínas.
Esta técnica tiene tres etapas: separación por tamaño, transferencia a un soporte
sólido y, finalmente, visualización mediante marcación de proteínas con el uso de
anticuerpos.

¿Qué detecta?
Permite la detección de una sola proteína dentro de una muestra biológica. La
especificidad de Western Blot se logra a través del uso de un anticuerpo que reconoce y se
une a un epítopo único de la proteína estudiada. Se puede estimar el tamaño de la proteína,
confirmar la presencia de modificaciones post-traduccionales (como la fosforilación), y ser
utilizado para comparar cuantitativamente los niveles de proteína entre muestras.

¿Qué utilidad clínica tiene?

Prueba de VIH, detecta los anticuerpos para el VIH en la sangre. Se transfieren las
proteínas de células infectadas a una membrana. El sistema inmune responde a la infección
por el VIH con la producción de anticuerpos contra ese virus.
También se utiliza en pruebas definitivas de la encefalopatía espongiforme bovina,
más conocida como "enfermedad de las vacas locas".

¿Ventajas y desventajas?
Ventajas
Alta sensibilidad 0,1 nanogramos de proteína.
Diagnostico eficaz temprano
Múltiples muestras y tipos de estudios
Desventajas
Tiene un alto costo
Variabilidad en las reacciones de las bandas según el ensayo, el tipo de muestras, las
condiciones técnicas.
Presenta problemas en las proteínas de fácil degradación

Northern blot

¿Qué es?
Es una técnica utilizada para la detección de moléculas de ARN, de una secuencia
dada dentro de una mezcla compleja (por ejemplo, un ARN mensajero para un péptido
dado en una muestra de ARN total).
Se toma la mezcla de ARN y se somete a una electroforesis en gel con la finalidad
de separar los fragmentos dependiendo de su tamaño. Tras esto, se transfiere el contenido
del gel, ya resuelto, a una membrana cargada positivamente en la que se realiza la
hibridación de una sonda molecular marcada radiactiva o químicamente.

¿Qué detecta?
Detecta moléculas de ARN específica en una muestra de sangre o tejido.

¿Qué utilidad clínica tiene?

Permite identificar un patrón específico de expresión genética entre tejidos, órganos,
estadios del desarrollo, niveles de estrés ambiental, infecciones originadas por patógenos y
su respectivo tratamiento. Esta técnica se usa para mostrar la sobreexpresión de oncogenes
y la desregulación de genes oncosupresores en células cancerosas cuando se comparan con
tejidos normales.
Tanto la técnica de Southern como de Northern blot se usan poco hoy en día al
haber sido sustituidas por técnicas derivadas de la PCR.
¿Ventajas y desventajas?

Ventaja
Detecta pequeños cambios en la expresión de genes que los microrrays no pueden
identificar. Además puede definir el tamaño de la cadena de ARN, la capacidad de observar
los productos del empalme alternativo, la posibilidad de usar sondas con homología parcial,
medir el tamaño y la calidad del ARN antes de realizar la inmovilización en la membrana y
finalmente otorga la opción de guardar la membrana para su posterior análisis.
Desventaja
Presenta problemas respecto a la degradación de la muestra por ribonucleasas
(endógenas de la muestra o a través de contaminación ambiental), lo que es posible evitar
con una esterilización adecuada de los materiales, así como el uso de inhibidores de RNasas
como el dietilpirocarbonato.