INFORME N° 3: EXTRACCIÓN DE ADN

Alessia Amín Gonzales, Laura Buelvas Mejía, Sady Hernández Chamorro & Paola Rivera
Universidad de Sucre
 INTRODUCCIÓN

Todo organismo vivo está formado por la ampliamente estudiada y conocida molécula de

DNA. (Martinez, L., 2015) El ADN está constituido por dos cadenas de nucleótidos unidas

entre sí formando una doble hélice. Los nucleótidos están integrados por un azúcar

(desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada (adenina, guanina, timina o

citosina). La unión de los nucleótidos ocurre entre el grupo fosfato y el azúcar, mediante

enlaces fosfodiéster, dando lugar al esqueleto de la molécula. Las bases de cadenas opuestas

se unen mediante puentes de hidrógeno y mantienen estable la estructura helicoidal.

Velázquez, L., et al (2014)

Por su parte, la extracción es el método por el cual se obtiene el ADN a partir de material

biológico (cepillado bucal, saliva, sangre o cualquier tejido) y se basa en las características

fisicoquímicas de la molécula. La extracción consiste en la separación y purificación del

ADN con el fin de poder estudiarlo, analizarlo o manipularlo.

En la investigación biomédica el ADN se utiliza para analizar y diagnosticar a pacientes con

enfermedades neurodegenerativas, cáncer, infecciones, entre otros. Checa, A., (2016).

Los métodos tradicionales, desarrollados en los años 50, utilizan solventes orgánicos para

separar a las proteínas del ADN y, una vez suspendido en la fase acuosa, aislarlo por

precipitación con etanol. Estos métodos requieren preparar soluciones y la extracción puede

tomar desde unas horas hasta varios días por los numerosos pasos que deben realizarse. En

general, los protocolos tradicionales consisten de cinco etapas principales: homogeneización

del tejido, lisis celular, separación de proteínas y lípidos, precipitación y redisolución del

ADN. Velázquez, L., et al (2014)

 OBJETIVOS

● Desarrollar habilidades y destrezas en la extracción de ADN.

● Extraer ADN de Bacterias (E. coli), Hongos (Fusarium spp., Colletotrichumspp.), o

de Plantas, por un método sencillo y efectivo.

MATERIALES Y REACTIVOS.

-Cultivo bacteriano o fúngico.

-Micro centrifuga de mesa.

-Viales

-Vortex

-Baño de maría a 65°C

-Buffer de extracción (NaCl 0.5M, Tris-HCl 0.2M, EDTA 10 mM, SDS 1%, H2O)

-Proteinasa K

-Acetato de Amonio 7.5 M.

-Buffer TE 10:1

-Cloroformo

-Alcohol isoamílico.

-Nitrógeno líquido

-Mortero

-Isopropanol
-Micropipetas

-Puntas estériles.

METODOLOGÍA

Se desarrollaron previamente las etapas que llevan a la obtención de colonias que se

desarrollan en un medio sólido (PDA) en una caja de Petri.

La primera etapa, en este punto, consiste en tomar una colonia del mismo y colocarla en un

medio líquido (Sabouraud) para el crecimiento de las hifas.

Extracción de ADN fúngico

1.Se disolvió la pared celular con una "mezcla digestiva" bufferada (buffer de extracción).

La mezcla contenía las enzimas necesarias para realizar dicha digestión.

2. Se transfirieron 50 mg del hongo deshidratado a tubo eppendorf estéril de 1.5 ml, y

se maceró en seco con mini pistilo de plástico estéril hasta pulverizarlo.

3. Se adicionó 600 µL de buffer de extracción (NaCl 0,5 M, Tris 0,2 M, EDTA 10

mM, SDS 1%, y Proteinasa K).

4. Se agitó en vortex para homogenizar la solución.

5. Se incubó a 60 – 65 ºC por una hora con agitaciones por inversión de 5 min.

cada 15 minutos de incubación.

6. Se agregó 150 µl de acetato de amonio 7,5 M agitar por inversión por 15 a 20

minutos a temperatura ambiente.

7. Se centrifugó a 12.000 r.p.m. por 15 minutos.

8. Se Transfirió el sobrenadante a un tubo eppendorf nuevo y agregar 250 µL de

cloroformo alcohol isoamilico (24:1) y mezclar por inversión durante 10 a 15

minutos.

9. Se centrifugó nuevamente a 12.000 r.p.m. durante 15 min.

10. Se transfirió el sobrenadante (~300 µL) a un nuevo tubo y agregar ½ del

volumen (~150 µL) en Isopropanol frío y se dejó precipitando en el congelador

durante toda la noche (mínimo durante 2 horas).

11. Se centrifugó a 12.000 r.p.m. durante 15 min.

12. Se eliminó el sobrenadante y se lavó el pellet con 150 µL de etanol frío al 70%,

dejando evaporar el etanol a temperatura ambiente.

13. Se agregó de 150-250 µL de TBE1X, dependiendo del tamaño del pellet.

14. Finalmente se conservó a -20°C hasta su próximo uso.

RESULTADOS Y ANÁLISIS

Siguiendo el procedimiento descrito anteriormente, se obtuvieron hebras de ADN del

hongo. Una de las principales dificultades en la extracción de ADN fúngico es la necesidad

de romper la pared celular, la cual varía en estructura y complejidad en las distintas especies.

Esta característica ha resultado en el hecho de que, a día de hoy, no exista un procedimiento

adecuado para la extracción eficiente de ADN de todas las especies fúngicas. Pérez, S., et al

(2010).

El método propuesto por Boehm, 1999, necesita de incubación con la proteinasa K de por lo

menos una hora, lo que prolonga por más tiempo el procedimiento de extracción o el de la

incubación a 65°C durante una hora (Pérez, S., et al., 2010), esto con el fin de facilitar la

ruptura de los tejidos y membranas celulares . Rosero, D. A., et al.,(2010).

El método de purificación que se utilizó para la práctica fue el de cloroformo-alcohol

isoamílico, sin embargo el mejor método para la purificación del ADN es el de

Fenol/cloroformo; ya que con el cloroformo/alcohol isoamílico no se obtiene ADN con la

misma calidad y cantidad que al solo usar fenol/Cloroformo. el método de fenol/ cloroformo

es de gran efectividad debido a que los ácidos nucleicos insolubles en fenol y solubles en

cloroformo se separaran en dos fases: la superior acuosa, donde están presentes los ácidos

nucleicos, y la fase del fondo con fenol y cloroformo y las demás moléculas, como proteínas

y grasas, que inhiben la amplificación de los ácidos nucleicos. (Alvis-Arango, A. A. 2015)

Además se empleó acetato de amonio 7,5 M para la precipitación de proteínas. (García, M., et

al., 2006 )

CONCLUSIÓN

Mediante la investigación propuesta se logró aislar fibras o hebras de ADN de tipo fúngica,

usando la incubación de la proteinasa K con el fin de de facilitar la ruptura de los tejidos y

membranas celulares; cabe resaltar que el metodo de purificacion usado en la investigación

(cloroformo/alcohol isoamílico) no produce ADN en cantidad y calidad con el que se podría

obtener usando fenol/cloroformo el cual separa el material genético en fases: superior acuosa

y la fase del fondo.

 CUESTIONARIO

1. ¿Existen diferencias significativas en los procesos de extracción de ADN de

células procarióticas, vegetales y animales? Justifique su respuesta.

Para la extracción y purificación de ácidos nucleicos es necesario establecer una serie de

protocolos seguros para la separación de los componentes celulares. El método a emplear

dependerá, sobre todo, del tejido que se utiliza y del uso que posteriormente se hará del

material genético extraído. Es necesario saber si el ADN es de origen viral, bacteriano,

vegetal y animal, pues este factor también influye en el método elegido, el cual debe permitir

la lisis celular causando el menor daño posible al DNA. La principal diferencia en los

métodos podría presentarse debido a la pared celular presente en los procariotas (y en algunos

grupos de eucariotas) lo que implica que se debe recurrir a una degradación enzimática de

dicha pared, además de los pasos tradicionales en una extracción (Gallego, R,. et.al. 2019)

2. ¿Se podrán realizar análisis genéticos de un organismo sin tener que realizar

procesos de extracción de ADN? Justifique.

Análisis genético es una prueba bastante compleja que se realiza en laboratorios

especializados. Su utilidad se basa en la determinación de la causa genética de determinadas

condiciones médicas. Para detectar las mutaciones realizar extracción de ADN de las células,

ya que sin este proceso no sería posible analizar las regiones del genoma que se quieren

estudiar. Cabe resaltar que si se pueden realizar análisis genéticos de un organismo sin tener

que realizar procesos de extracción genética, analizando solo el cariotipo del organismo. Se

centra en el estudio de variantes cromosómicas específicas que constituyen un factor de

riesgo genético: Los cromosomas se analizan a partir de células que se obtienen de la

recogida de tejidos y su cultivo en condiciones adecuadas, para conseguir células en una

etapa de la división celular que permita visualizar los cromosomas (s.f)

3. Que características posee la bacteria Erwinia carotovora subsp. carotovora que

hace difícil su identificación por métodos tradicionales y que procedimientos

moleculares se utilizan en la actualidad para su identificación; descríbalos

brevemente.

La bacteria Erwinia Carotovora subsp. Carotova al ser examinada por medio de métodos

genéticos y bioquímicos con el fin de averiguar su diversidad genómica, dió como resultado

cepas aisladas de un nicho ecológico muy diversas en comparación con patógenos

relacionados. Una comparación de 23 secuencias parciales de mdh reveló una diferencia

máxima por pares de 10,49% y una diferencia media por pares de 2,13%, valores que son

mucho mayores que la variación máxima (1,81%) y la variación media (0,75%) previamente

informada para Escherichia coli. Se detectaron plásmidos grandes en dos cepas, incluida la

cepa modelo E. carotovora subsp. carotovora. Las dos cepas menos virulentas tenían una

estructura cromosómica inusual, lo que sugiere que un pulsotipo particular está

correlacionado con la virulencia. La especie fitopatógena Erwinia carotovora es un taxón

complejo que consta de cepas con una variedad de características fenotípicas, bioquímicas, de

hospedadores y genéticos diferentes. Esta especie es muy adecuada para estudiar la ecología,

especiación y patogenicidad de patógenos enterobacterianos, ya que está muy extendida en el

medio ambiente, puede infectar numerosas especies de plantas y se han identificado muchos

de sus genes de virulencia, incluidos genes que codifican enzimas degradantes. , diversos

sistemas reguladores y el sistema de secreción tipo III (TTSS). (Persson, P & Sletten, A.

1995)
Algunos procedimientos con los que es posible analizar estas bacterias es mediante perfiles

de ácidos grasos, utilizando un cromatógrafo de gases y un paquete de software comercial

para el procesamiento de datos. El perfil de ácidos grasos es un método rápido, fiable y

reproducible para la identificación y diferenciación de estas bacterias. También se utiliza un

cebador de arroz universal (URP, 20 mer) desarrollado a partir de una secuencia repetitiva de

arroz para producir huellas dactilares de ADN por PCR de Erwinis spp. En E. carotovora

subsp. carotovora, el cebador URP2F amplifica las bandas polimórficas que se distinguen de

otras Erwinia spp (Hadas, R., Et. al. 2001)

4. ¿Cuáles son las diferencias significativas entre la extracción de ADN y la de

ARN?

A pesar de que ambos son procedimientos de purificación y extracción de ácidos nucleicos

las diferencias comienzan, evidentemente, desde el tipo de ácido nucleico extraído (RNA Y

DNA). También se diferencian en el pH, que en el caso de ADN está a un nivel de pH de 8 y

en el caso del RNA es de 4.7. Para el caso del ADN el proceso consta de romper las

membranas celulares o la lisis celular, eliminar los lípidos de la membrana y precipitando el

ADN. El proceso es el caso de RNA consta de lisis celular, extracción de tiocianato de fenol-

cloroformo de guanidinio, preparación con isopropanol. Además de ello, el almacenamiento

de DNA a largo plazo se hace a -20°C y la de ARN a -80°C (Ramos, S. 2017)

5. ¿Cómo distinguiría si posee una muestra de de DNA contaminada con Fenol? ¿Y si

estuviera contaminada con Proteínas? ¿Qué haría en cada caso para descontaminarlas?

Es posible identificar muestras de ADN contaminadas por medio de espectrofotometría

principalmente. Para descontaminar una muestra contaminada con fenol se puede lavar con

cloroformo y precipitado con isopropanol con un posterior lavado con EtOH al 75%. Con
respecto al ADN contaminado por proteínas, se podría usar un tampón con alto contenido en

sal que puede conseguir separar al ADN de las proteínas (s.f)

BIBLIOGRAFÍA

● Checa, A., (2016). Extracción de ADN. Conogasi.Conocimiento para la vida.

● Velázquez, L, Martínez, M., & Romero, A. C. (2014). Extracción y purificación de

ADN. Herramientas moleculares aplicadas en ecología: aspectos teóricos y prácticos.

Universidad Nacional Autónoma de México y Universidad Autónoma Metropolitana.

● Martínez, L., (2015). “EXTRACCIÓN DE DNA” Experimento con reactivos de la

vida cotidiana.

● Extracción de ADN - Aula Genyca. (2018, 1 marzo). Aula Genyca.

https://www.aulagenyca.com/extraccion-de-adn/

● Persson, P., & Sletten, A. (1995). Fatty acid analysis for the identification of Erwinia

carotovora subsp. atroseptica and E. carotovora subsp. carotovora 1. EPPO Bulletin,

25(1‐2), 151-156.

● Hadas, R., Kritzman, G., Gefen, T., & Manulis, S. (2001). Detection, quantification

and characterization of Erwinia carotovora ssp. carotovora contaminating pepper

seeds. Plant pathology, 50(1), 117-123.

● Yap, M. N., Barak, J. D., & Charkowski, A. O. (2004). Genomic diversity of Erwinia

carotovora subsp. carotovora and its correlation with virulence. Applied and

environmental microbiology, 70(5), 3013-3023.

● Ramos, S. (2017, 15 noviembre). Extracción y análisis de ARN y ADN. Analitek.

http://blog.analitek.com/extracci%C3%B3n-y-an%C3%A1lisis-de-arn-y-adn-0-0
● García, M., Benavente, M., Melo A, Roa, I., Roa, J., (2006) Efecto de la fijación en la

calidad del ADN: estudio controlado con cinco fijadores. Rev ESPAÑOLA DE

PATOLOGÍA, 39(3)

● Rosero, D. A., Gutiérrez, L. A., Cienfuegos, A. V., Jaramillo, L. M., & Correa, M. M.

(2010). Optimización de un procedimiento de extracción de ADN para mosquitos

anofelinos. Rev Colomb Entomol, 36, 260-263.

● Pérez, S. Á., Blanco, J. L., García, M. E., & García, P. (2010). Aislamiento de ADN

de hongos: comparación de métodos manuales con un nuevo procedimiento

semiautomático. Laboratorio Veterinario Avedila, (51), 2-15.

● Alvis-Arango, A. A. (2015). Evaluación de los métodos fenol-cloroformo y columnas

de sílice para extracción de ADN a partir de tejido óseo. Colombia Forense, 2(1), 69-

74.

● Gallego, R. E., Marcos-Merino, J. M., & Ochoa de Alda, J. G. (2019). Extracción de

ADN con material cotidiano: diseño, implementación y validación de una

intervención activa interdisciplinar. Educación química, 30(1), 42-57.

● Genetic analysis. (s. f.). TheFreeDictionary.com. Recuperado 25 de octubre de 2020

de https://medical-dictionary.thefreedictionary.com/Genetic+analysis

● DNA & RNA Extraction Products | Thermo Fisher Scientific - NL. (s. f.). Thermo

Fisher Scientific. Recuperado 27 de octubre de 2020, de

https://www.thermofisher.com/nl/en/home/life-science/dna-rna-purification-

analysis.html

● Genetic analysis. (s. f.). TheFreeDictionary.com. Recuperado 25 de octubre de 2010,

de https://medical-dictionary.thefreedictionary.com/Genetic+analysis