Extracción de DNA bacteriano de Escherichia Coli y

amplificación por PCR

𝑎 𝑎 𝑎
Delgado Gutierrez Daniela , Valencia Apolinario Dulce , Huamani Ttito José
𝑎
Universidad Catolica de Santa Maria, Arequipa, Perú

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RESUMEN

En esta investigación, se llevó a cabo la extracción de ADN de Escherichia coli utilizando el método
de fenol-cloroformo. Se destacó la importancia de obtener una extracción precisa de ADN bacteriano
para comprender la genética de E. coli y su aplicación en diversos campos científicos y
biotecnológicos. Además, se describieron detalladamente los pasos de extracción de ADN, así como
los resultados obtenidos mediante electroforesis para evaluar la calidad y concentración del ADN
extraído. Se concluyó que el método de extracción de fenol-cloroformo puede afectar la integridad y
concentración del ADN, y se sugirió la exploración de métodos alternativos y la optimización de los
protocolos de extracción para obtener resultados más confiables. Asimismo, se resaltó la importancia
del correcto almacenamiento de las muestras de ADN para preservar su integridad. En resumen, este
estudio abordó de manera exhaustiva la extracción de ADN de E. coli, la amplificación por PCR y la
necesidad de mejorar los métodos de extracción para obtener ADN de alta calidad en aplicaciones
científicas y biotecnológicas.

Palabras clave: Extracción DNA, fenol-cloroformo, PCR, Escherichia Coli

ABSTRACT

In this research, the extraction of Escherichia coli DNA was performed using the phenol-chloroform
method. The importance of obtaining precise extraction of bacterial DNA to understand the genetics
of E. coli and its application in various scientific and biotechnological fields was highlighted. The
steps of DNA extraction were described in detail, along with the results obtained through
electrophoresis to assess the quality and concentration of the extracted DNA. It was concluded that the
phenol-chloroform extraction method can affect the integrity and concentration of the DNA, and the
exploration of alternative methods and optimization of extraction protocols were suggested to achieve
more reliable results. The significance of proper storage of DNA samples to preserve their integrity
was also emphasized. In summary, this study comprehensively addressed the extraction of E. coli
DNA, PCR amplification, and the need to improve extraction methods to obtain high-quality DNA for
scientific and biotechnological applications

Keywords: DNA extraction, phenol-chloroform, PCR, Escherichia Coli

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1. Introducción
El estudio de la genética bacteriana ha revolucionado numerosos campos científicos y
biotecnológicos, permitiéndonos comprender a fondo el funcionamiento de
microorganismos significativos en nuestro entorno. En este sentido, la extracción de
ADN de Escherichia coli y la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) han
demostrado ser dos técnicas fundamentales en la investigación molecular.
Escherichia coli, es una bacteria muy utilizada en investigaciones genéticas, ha sido
objeto de estudio debido a su facilidad de cultivo y a su relevancia experimental [1].
Esta bacteria se encuentra naturalmente en el intestino de mamíferos, pero ciertas
cepas pueden ser patógenas y causar enfermedades.
Extraer y purificar el ADN de E. coli es un paso crucial para entender su genética, así
como para aplicaciones en diversos campos de la biotecnología, la medicina y la
agricultura. La extracción de ADN de Escherichia Coli para obtener el material
genético con el fin de realizar posteriores análisis, puede ser utilizado para estudiar la
estructura y función de los genes, así como para su identificación. [5]
La importancia del gen en bacterias es debido a que es la unidad funcional del
cromosoma bacteriano, el cual es una secuencia ordenada de nucleótidos de ADN que
contiene la información necesaria para la síntesis de una macromolécula con función
celular específica, habitualmente proteínas pero también ARNm, ARNr y ARNt [1].
Los genomas bacterianos contienen miles de genes diferentes que codifican proteínas,
cada una con su propio papel en un proceso, tal como el metabolismo de la energía, el
mantenimiento de la estructura de la célula y la defensa contra los virus [3].
Estudiando los genomas de bacterias, podemos entender mejor sus capacidades
metabólicas, su capacidad de causar enfermedad y también su capacidad de sobrevivir
[2]. La PCR se puede utilizar para identificar bacterias específicas en muestras
biológicas, como sangre, orina, heces y alimentos. Los cebadores específicos se
diseñan para amplificar una región del ADN de la bacteria de interés, lo que permite
su detección y posterior identificación[6][7]. También se utiliza en el diagnóstico de
enfermedades infecciosas, como la detección de patógenos en muestras clínicas. La
técnica es muy sensible y específica, lo que permite la detección temprana de la
infección y la identificación del patógeno causante, aplicaciones muy útiles en el
campo médico. [8]
También se realizaron estudios en base a que bacterias tienen moléculas reguladoras
específicas que controlan si un gen particular será transcrito en el ARNm. A menudo,
estas moléculas actúan al unirse al ADN cerca del gen y ayudan o bloquean la enzima
de la transcripción, la ARN polimerasa [3]. La regulación génica permite que las
bacterias respondan a los cambios en su entorno y ajusten su comportamiento en
consecuencia[3], siguiendo esta línea las bacterias se pueden utilizar como fábricas de
proteínas/enzimas, y si un plásmido contiene las secuencias de control adecuadas, se
puede inducir a las bacterias a expresar el gen que contienen al agregar una señal
química, la expresión del gen conduce a la producción de ARNm que se traduce en
proteína[4].
Es así como a través de la extracción precisa de ADN bacteriano y la amplificación
específica de fragmentos mediante PCR, se abren numerosas posibilidades para la
 comprensión de la genética bacteriana y su aplicación en diversas áreas científicas y
biotecnológicas.

2. Objetivos
- Conocer y aplicar el método de fenol-cloroformo para la extracción de ADN
de células de E. coli.
- Evaluar la cantidad de ADN extraído utilizando la técnica cualitativa de
electroforesis, para determinar la eficiencia del método de extracción.
- Evaluar la concentración e integridad de la muestra de ADN de E. coli
extraída.
3. Materiales y métodos
3.1 Extracción de ADN bacteriano
Se extrajo una pequeña muestra de un cultivo de E. coli. Para ello se desinfectó el área
de trabajo, se prendió el mechero bunsen y con ayuda de un asa de col se extrajo una
colonia aislada de tamaño pequeño a regular como muestra y se disolvieron en 200 µl
de buffer de Lisis en un tubo eppendorf.
Con el fin de llegar al material genético, rompiendo la pared celular de la E.Coli se
agregaron perlas de vidrio al tubo eppendorf y se llevó al Vortex por 3 minutos. Al
finalizar se llevó la muestra a la centrífuga por 1 minuto a 2500 rpm, al salir de la
centrífuga se traspasó la muestra a otro tubo eppendorf quedando en el anterior las
perlas añadidas con anterioridad y ya en el nuevo tubo se le añadió 10 µl de
proteinasa K (p°K) se homogeneizó y seguidamente se llevó a incubar en el en el
Thermo-Shaker a 56°C por 30 minutos.
Después de la incubación, se agregó 600 µl de solución fenol-cloroformo a la muestra
y para mezclar, el tubo se llevó a agitación leve en el vortex durante 10 segundos,
cuidando de que no se genere espuma. A continuación se lleva a centrifugar por 5
minutos a 10 000 rpm. Cuando finaliza la centrifugación se debe observar la
formación de 3 fases en la muestra, y se extrajo con una micropipeta solo la I fase de
la superficie y se depositó en un tubo eppendorf nuevo, las otras dos fases se
desecharon.
Luego se adiciono 800 µl de isopropanol “FRÍO” a la muestra y se refrigero para a
incubar en hielo durante 10 minutos. Una vez culminado el tiempo, el tubo de la
muestra se llevó nuevamente a la centrífuga a 10,000 rpm durante 5 minutos.
Es después de esta centrifugación, se observa la formación del pellet bacteriano por
ello eliminamos el isopropanol que está como sobrenadante para solo quedarnos con
el pellet.
Posteriormente se realizó un lavado/limpieza y para ello se añadió 500µl de EtOH al
70% “FRÍO” y se lleva a centrifugar en frío por 1 minuto a 10 000 rpm. Al salir de la
centrífuga se eliminó el EtOH y luego se colocó el tubo en un rack con la tapa abierta
para evaporar el etanol restante.
Para finalizar se añadió 50 µl de agua molecular al tubo con el pellet para disolverlo y
para homogeneizar, se llevó al vortex durante 5-10 minutos. Y finalmente obtenemos
ADN de E.coli.
3.2 Electroforesis de extracción de ADN
Se preparó un gel de Agarosa al 1% para la evaluación de la extracción de ADN. Para
ello se pesó 0.30g de agarosa y se mezcló con 30 mL de TAE 1X, todo se colocó en
un matraz y se llevó al microondas para diluir por alrededor de 1-3 minuto hasta tener
una solución clara. Se dejó enfriar a T° ambiente y luego se agregó 2 µl de
intercalante. El gel se vertió en la cámara molde y se dejó solidificar con el peine
colocado para crear los pozos donde se cargarán las muestras.
Se agregó alrededor de medio litro de buffer de corrida TAE 1X a la cámara de
electroforesis, hasta cubrir el gel de agarosa previamente desmoldado. En una pedazo
de Parafilm se preparó la mezcla, utilizando de superficie se agregó 1 µl de loading
buffer a una concentración de 5X junto con 5µl del ADN extraído, se resuspendió
para mezclar con la micropipeta y se depositó la mezcla a su volumen total de 6µ en
el pozo del gel, cuidando de no perforar este.
Al tener listas las muestras en los pozos, se tapó la cámara de electroforesis, se
encendió la fuente de poder y se programó a 100V, dejándolo por 1 hora para la
corrida. Al transcurrir el tiempo programado se llevó el gel al transiluminador para
verificar si se logró conseguir la extracción de ADN bacteriano, evaluando si las
muestras depositadas corrieron en el gel o no.

3.3 PCR punto final

Para preparar la mezcla, todos los reactivos utilizados estuvieron previamente
descongelados. Y se preparó una muestra y un control negativo en tubos de PCR,
según los volúmenes de la siguiente tabla:

Luego se homogeneizó la mezcla, terminada la preparación del Mix de PCR se llevó

al Termociclador para realizar la amplificación de los productos. La reacción se
programa en el termociclador de acuerdo al protocolo establecido en la siguiente
tabla.
 Cada ciclo de temperatura se repite para amplificar exponencialmente el gen de
estudio durante 2 horas, generando múltiples copias del mismo.

3.4 Electroforesis de PCR

Al terminar el tiempo de amplificación, se evaluó el resultado de la PCR realizando
una electroforesis.
Para ello se pesó 2.25 g de agarosa para preparar un gel de agarosa al 1.5% y se
diluyó en 150 mL de TAE, todo se colocó en un matraz y se llevó a disolver en el
microondas por 1-3 minutos aproximadamente hasta tener una solución clarificada.
Una vez disuelto se dejó enfriar a T° ambiente y se agregó 15 uL de intercalante
seguidamente se mezcló y se colocó el gel de agarosa en el molde, se colocó el peine
para la formación de los pozos y se dejó solidificar. Después de desmoldarlo, el gel se
depositó en la cámara de electroforesis y se llenó la cámara con los 2 L de buffer de
corrida TAE 1X, hasta cubrir el gel.
Con la micropipeta se midió 8 uL de de la muestra de PCR, al igual que con los
controles y el marcador, para introducir su contenido en los pozos, evitando romper el
agar. Se tapó la cámara de electroforesis, se conectaron los electrodos, se prendió la
fuente de poder y se programó a 100 V por 1 hora.
Transcurrido el tiempo se llevó el gel al transiluminador para observar la corrida de
las bandas.

4. Resultados
4.1. Evaluación de primers brindados para la PCR:

Figura 1. Evaluación de la temperatura de melting de los primers forward y reverse

 Observamos que el primer reverse y el primer forward tienen una adecuada
concentración de citosinas y guaninas y una temperatura de melting que está dentro
de los parámetros adecuados para el diseño de primers.

4.2. Electroforesis de la extracción de ADN de E. coli:

Se evaluó la concentración cualitativa de ADN mediante electroforesis. Durante este
paso, la muestra de ADN fue expuesta a una fuente de luz ultravioleta emitida por el
transiluminador a un voltaje de 100 durante 1 hora, el gel de agarosa tuvo una
concentración al 1%. Al analizar los resultados obtenidos, se pudo observar
claramente una banda en el transiluminador, lo cual indica la presencia de ADN en la
muestra analizada. La nitidez y la intensidad de la banda sugieren que el ADN
extraído posiblemente se encuentra en buen estado y es adecuado para su uso en
análisis y experimentos posteriores. Estos resultados son alentadores, ya que una
banda definida en el transiluminador indica que el proceso de extracción de ADN se
realizó con éxito y que el ADN obtenido tiene un potencial adecuado para su
aplicación en estudios científicos y genéticos.

Figura 2. Resultados de electroforesis de extracción de ADN de E. coli.

4.3. Electroforesis de la PCR:

Durante el proceso de amplificación del ADN a través de la técnica de Reacción en
Cadena de la Polimerasa (PCR), se llevaron a cabo dos etapas importantes: la
amplificación propiamente dicha y la posterior visualización de los resultados en un
transiluminador. Una vez finalizada la PCR, los productos amplificados se cargaron
en un gel de agarosa al 1.5%, con un voltaje de 100v durante 1 hora.
 Después de esta separación, se utilizó un transiluminador que emite luz ultravioleta
para visualizar los resultados en el gel de agarosa. La presencia de una banda clara y
definida en el transiluminador sugiere una concentración posiblemente adecuada de
los productos amplificados de ADN.

Figura 3. Electroforesis de la PCR, donde m es el marcador, M es la muestra a analizar, (-)

es el control negativo y (+) es el control positivo.
4.4 Calidad del ADN

Concentra ABS 260/280 ABS 260/230 ABS 260 ABS 280

ción

13.1 ug/ml 1.91 1.72 0.26 0.14

5. Discusión
Para el estudio de ácidos nucleicos, ya sea el ADN o el ARN, es necesario que estos
tengan una buena concentración, una buena calidad y que su integridad no esté
comprometida, pero estos factores pueden variar según el método utilizado. Para esta
investigación se realizó la extracción con el método de fenol, cuya metodología
requiere de muchos pasos y toma mucho más tiempo a diferencia de los demás
métodos, lo cual podría afectar a la integridad del ADN o a la concentración de la
misma[9]. Además, el método de fenol-cloroformo contiene tiocianato de guanidina,
el cual sí puede afectar directamente al ADN. Por otro lado, la ABS 260/230 nos
indica que hay una ligera contaminación, esto podría deberse a que el método
utilizado tiene dificultades a la hora de eliminar la contaminación por fenoles e
hidratos de carbono[10]. En cambio, la baja concentración de ADN que se obtuvo
podría deber a exceso de pasos que lleva el método[9]. Otro factor que pudo haber
afectado la concentración de ADN fue el mal almacenamiento de la muestra, ya que
si no se encuentra a -20°C, habrá pérdida en el ADN[11]. Finalmente, el análisis por
electroforesis del ADN en la figura 2 muestra que su integridad no está tan
comprometida, igualmente el análisis post PCR nos indica que hubo una buena
amplificación.
6. Conclusiones
En esta investigación, se utilizó el método de extracción de ácidos nucleicos con
fenol-cloroformo. Sin embargo, se concluyó que este método puede comprometer la
integridad y la concentración del ADN debido a la complejidad y la duración de los
pasos involucrados.
Además, se observó una ligera contaminación por fenoles e hidratos de carbono, lo
que indica dificultades para eliminar completamente estas impurezas. La baja
concentración de ADN obtenida puede ser atribuida a la inclusión de exceso de pasos
en el método de extracción y al almacenamiento inadecuado de las muestras.

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