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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN


DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
SECCIÓN BIOQUÍMICA Y FARMACOLOGÍA HUMANAS
LICENCIATURA EN BIOQUÍMICA DIAGNÓSTICA
GENÉTICA MOLECULAR LABORATORIO
GRUPO 2651

Informe de la práctica 7 Y 8: Aislamiento y purificación de plásmidos/Digestión de


DNA con endonucleasas de restricción.

Equipo 3
Chaparro Camacho Diana Andrea
Huerta Silva Jesús Eduardo
Vera Maldonado Karol Scarlet
Zavaleta Ojeda Karen Adeydi

FECHA DE ENTREGA: 14 de mayo de 2018

PROFESORES: Dra. María Eugenia Aranda Barradas


Q.F.B. Nydia B. González Ángeles
B.Q.D. Larisa Andrea González Salce
Aislamiento y purificación del plásmido Pdest 22 por la técnica de Miniprep y su
digestión con enzimas de restricción (EcoRI y Hind III)

Resumen
La ingeniería genética utiliza una serie de técnicas que permiten la modificación de los
ácidos nucleicos que conforman los genes. Un descubrimiento que permitió el surgimiento
de esta rama de la ciencia fue el de los elementos genéticos móviles en bacterias y
levaduras que se encuentran de manera libre en su citoplasma. Entre ellos, ocupando un
lugar destacado, están los plásmidos y las enzimas de restricción. Debido a la importancia
que esto como uno de los pasos previos de trabajos de alta importancia, como
secuenciación y clonación, en el trabajo siguiente se realizó el aislamiento y purificación de
DNA plasmídico de una cepa de E. Coli por lisis alcalina (Miniprep), comprobando ello con
el índice 260/280; posteriormente se llevó a cabo la digestión del mismo usando EcoRI,
HindIII y una mezcla de ambos para observar a través de electroforesis el número y el
tamaño de los cortes producidos. Por medio de esto se obtuvo una purificación exitosa con
un índice 260/280 de 1.82, encontrándose después de la digestión un corte con EcoRI de
2923 pb, dos con Hind III de 6000 y 4000 pb y tres cortes con una mezcla de ambos, de
tamaños 5853, 1077 y 2000 pb, respectivamente.

Palabras clave: Plásmidos, pDEST22, lisis alcalina, enzimas de restricción, EcoRI, Hind III,
indice 260/280, electroforesis, extremos romos, extremos cohesivos.

Abstract
Genetic engineering uses a series of techniques that allow the modification of the nucleic
acids that make up the genes. A discovery that allowed the emergence of this branch of
science was the mobile genetic elements in bacteria and yeasts that are found freely in their
cytoplasm. Among them, occupying a prominent place, are plasmids and restriction
enzymes. Due to the importance of this as one of the previous steps of high-importance
work, such as sequencing and cloning, in the following work the isolation and purification of
plasmid DNA of an E. Coli strain by alkaline lysis (Miniprep) was performed, checking it with
the index 260/280; later digestion was carried out using EcoRI, HindIII and a mixture of both
to observe through electrophoresis the number and size of the cuts produced. By means of
this a successful purification was obtained with an index 260/280 of 1.82, being after the
digestion a cut with EcoRI of 2923 bp, two with Hind III of 6000 and 4000 bp and three cuts
with a mixture of both, of sizes 5853, 1077 and 2000 bp, respectively.

Keywords: Plasmids, pDEST22, alkaline lysis, restriction enzymes, EcoRI, Hind III, index
260/280, electrophoresis, blunt ends, cohesive ends.

Introducción biotecnología, a través de la generación


La ingeniería genética utiliza una serie de de organismos transgénicos u organismos
técnicas que permiten la modificación de genéticamente modificados, así como
los ácidos nucleicos que conforman los para el aislamiento de determinadas
genes. Dichas modificaciones resultan de proteínas para su estudio profundo. Un
gran importancia en la elaboración de descubrimiento que permitió el
muchas sustancias por medio de la surgimiento de esta rama de la ciencia fue
el de los elementos genéticos móviles en dividían la columna central del DNA en
bacterias y levaduras que se encuentran sitios específicos en ambas cadenas de la
de manera libre en su citoplasma. Entre hélice doble.
ellos, ocupando un lugar destacado, están Estas enzimas se conocen como
los plásmidos (Rajchenberg, 2008). endonucleasas de restricción o enzimas
Los plásmidos son elementos genéticos de restricción. Las secuencias que la
extracromosómicos que se han mayoría de las enzimas reconocen miden
encontrado esencialmente en todos los cuatro a seis nucleótidos de largo y se
tipos de bacterias estudiadas hasta la caracterizan por un tipo particular de
fecha y tiene un origen de replicación simetría interna. Sin embargo, algunos
autónomo. Dependiendo de su tamaño producen extremos romos (Karp, 2005).
pueden codificar desde unas cuantas La DNA ligasa es una enzima que une
proteínas hasta cientos de ellas, los DNA. Si dos fragmentos de éste tienen
plásmidos varían ampliamente en tamaño, extremos complementarios, la ligasa
desde miles a cientos de miles de pares puede unirlos para formar una molécula
de bases (un tamaño comparable al única e intacta de DNA.
cromosoma bacteriano) y son, con mayor En la clonación de DNA, se utilizan
frecuencia, moléculas circulares de DNA enzimas de restricción y DNA ligasa para
de doble cadena (Loezada, 2004). insertar genes y otros fragmentos de DNA
Existen diferentes técnicas para aislar el en plásmidos.
DNA plasmídico y uno de los métodos Esto permite, entre otros usos, realizar
más usado es el método de extracción por modificaciones en la molécula de DNA, lo
lisis alcalina. Este método aprovecha las cual tiene muchas aplicaciones en la
diferencias en el tamaño y la biotecnología.
superhelicidad que es el grado de torsión Esto se puede usar para estudiar la
que sufre el DNA plasmídico en contraste expresión de un gen, para producir
con el cromosomal. La mayoría de los proteínas para tratamientos de
cromosomas bacterianos, son moléculas enfermedades, vacunas, y con otros fines.
circulares extremadamente grandes que Debido a la importancia que esto tiene en
no se encuentran superenrollados, varios campos de la genética molecular,
mientras que los plásmidos son moléculas como uno de los pasos previos de
pequeñas y superenrolladas. Durante el trabajos de alta importancia, en el trabajo
proceso de extracción, se busca siguiente se tiene como objetivo, realizar
desnaturalizar el DNA plasmídico y el el aislamiento y purificación del DNA
cromosomal y posteriormente plasmídico de una cepa de E. Coli por lisis
renaturalizar, con el fin de que el DNA alcalina (Miniprep) y posteriormente llevar
cromosomal, no se aparee rápidamente y a cabo la digestión del mismo usando
pueda ser atrapado por complejos EcoRI, HindIII y una mezcla de ambos
proteicos, los cuales precipitaron; a para observar a través de electroforesis el
diferencia del DNA plasmídico que número y tamaño de los cortes
rápidamente se renaturaliza y adquirirá su producidos.
conformación natural (Checa, 2017).
Durante el decenio de 1970 se encontró Metodología
que las bacterias contenían nucleasas
que reconocían secuencias cortas de Consultar el Manual de Laboratorio de
nucleótidos dentro de un DNA doble y Genética Molecular, correspondiente a la
práctica 7 y 8: Aislamiento y purificación
3 3406.03 1.828
de plásmidos/Digestión de DNA con
endonucleasas de restricción, págs. 58- 4 3627.25 1.615
70. Cuantificación, así como cálculo de índice
realizada por espectrofotometría en el equipo
Resultados Epoch.

Se llevó a cabo la extracción de plásmidos Fig 1. Electroforesis del plásmido extraído


de bacterias de Escherichia coli por el y su correspondiente digestión
método miniprep, cada equipo de trabajo
extrajo DNA plasmídico correspondiente a
Pdest22, se determinó la concentración
de este por espectrofotometría en
microplaca así como índices 260/280, Se
realizaron 3 digestiones con
endonucleasas, 2 simples y una doble, se
hizo correr una electroforesis en gel de
agarosa al 1% del DNA plasmídico sin
digerir y con su correspondiente digestión La concentración del gel de agarosa es al 1%, en
donde se observaron bandas para el rojo se tiene lo colocado en cada pozo, M marcador
DNA del plásmido con un peso de peso molecular de 10000 a 1000 pares de bases,
aproximado de 9000 pb y para el material Pl plásmido extraído, el número corresponde al
digerido sencillamente con la equipo que lo llevó a cabo, D es la correspondiente
endonucleasa EcoRI, una banda digestión, en morado digestión sencilla de PL1 con
aproximadamente 8000 pb, con HindIII EcoRI, en amarillo PL2 digestión sencilla con
HindIII, En azul digestión doble de PL3 y PL4 con
dos bandas la primera a los 6000 pb y la
EcoRI e HindIII, en rosa y en verde se observan
segunda a los 4000 pb aproximadamente,
bandas poco definida características de
con respecto a la digestión doble llevada contaminación con proteínas.
a cabo con las enzimas anteriores se
observan 3 bandas la primera a 6000 pb Fig 2. Mapa genético del plásmido Pdest22
la segunda 3000 pb y la tercera a 1000 pb
aproximadamente.
Se realizó un análisis bioinformático
apoyándose de la base de datos
NEBcutter que permite realizar
digestiones teóricamente y de esta forma
contrastar resultados experimentales.

Tabla 1. Concentración e índices 260/280


de los plásmidos extraídos
Equipo Concentración índice
en ng/uL 260/280
Mapa obtenido de la base de datos NEBcutter
donde se observa sitios de origen de replicación,
1 2389.9 1.914 “a”:Ampicilina “e”:pUC “g”:pADH1 “d”:ADH1TT
“c”:F1ori “h”: TRP1 “b”: ARS/CEN. así como los
2 3455.05 1.572
sitios y enzimas de restricción que pueden digerir el Fig 5. Mapa genético de Pdest22 digestión
plásmido. sencilla con HindIII

Fig 3. Mapa genético de Pdest22 digestión


sencilla con EcoRI

Mapa de Pdest22 obtenido de la base de datos


NEBcutter donde se observa sitios de origen de
replicación, la endonucleasa HindIII corta entre
Mapa de Pdest22 obtenido de la base de datos los nucleótidos 868,869 y entre 4540,4541 dando
NEBcutter donde se observa sitios de origen de
como resultado dos fragmentos de 5251 pb y 3672
replicación, la endonucleasa EcoRI corta entre los
pb.
nucleótidos 1851 y 1852 dando como resultado un
fragmento lineal

Fig 6. Electroforesis teórica de la digestión


Fig 4. Electroforesis teórica de la digestión
de Pdest22 con la endonucleasa HindIII
de Pdest22 con la endonucleasa EcoRI

Imagen de gel al 1% de agarosa, obtenido de la


base de datos NEBcutter donde se observan dos
Imagen de gel al 1% de agarosa, obtenido de la bandas con un peso 5251 pb y 3672 pb cuando se
base de datos NEBcutter donde se observa una digiere Pdest22 con la endonucleasa HindIII.
banda con un peso de 8923 pb. cuando se digiere
Pdest22 con la endonucleasa EcoRI.
Fig 7. Mapa genético de Pdest22, digerida Discusión
doblemente con EcoRI y HindIII
El uso de antibiótico se hace para poder
seleccionar aquella colonia (s) que tengan
el plásmido, en este caso pDEST22 de
8923 pb contiene un gen que les confiere
la resistencia a la ampicilina. Por ello, el
crecimiento de las células transformadas
(células que han recibido el plásmido) se
puede identificar sobre un medio de agar
que contenga el antibiótico.
El método de Miniprep aprovecha las
diferencias entre el DNA cromosómico y el
plasmídico por sus diferencias en tamaño,
pudiendo fragmentar y desnaturalizar el
DNA cromosómico de forma selectiva y
finalmente renaturalizar el DNA
plasmídico en el sobrenadante junto con
Mapa de Pdest22 obtenido de la base de datos el RNA, es por esto que en uno de los
NEBcutter donde se observa sitios de origen de pasos posteriores fue necesario agregar
replicación, la endonucleasa HindIII corta entre RNAsa para obtener el DNA plasmídico lo
los nucleótidos 868,869 y entre 4540,4541 y la más puro posible.
endonucleasa EcoRI corta entre los nucleótidos El índice 260/280 obtenidos, permiten
1851 y 1852 dando como resultado tres fragmentos comprobar que no hay presencia de
de 5251pb, 2689 pb y 983pb.
impurezas, restos de los reactivos durante
la lisis alcalina o RNA, que pueda interferir
en la digestión del DNA, los únicos
Fig 8. Electroforesis teórica de la valores que se encuentran fuera del rango
corresponden al equipo 2 y 4 (tabla 1)
digestión doble de Pdest22 con las
sabiendo que el índice debe ir de 1.8 a
endonucleasas HindIII y EcoRI
1.9 para considerar una muestra pura, los
valores de estos índices puede deberse
por algunos restos de proteínas que
acompañe al plásmido ya que los valores
son menores a 1.8 y esteefecto se ve
provocado por que las proteínas tienen
absorbancia a 280 lo que hace que al
hacer la relación el valor de este índice
baje (Bancoadn,2016).
Imagen de gel al 1% de agarosa, obtenido de la
base de datos NEBcutter donde se observan tres Los fragmentos generados a través de la
bandas con un peso 5251 pb, 2689 pb y 983pb digestión por las enzimas de restricción se
cuando se digiere Pdest22 con las endonucleasas analiza por electroforesis en gel de
HindIII y EcoRI. agarosa al 1%.las enzimas trabajadas
fueron EcoRI y HindIII, la endonucleasa
EcoRI reconoce y corta este sitio
G-A ATTC en sentido 5’-3’, mientras que Es importante mencionar que existen
HindIII reconoce y corta la secuencia A- otros factores que permiten que una
AGCTT en sentido 5’-3’ ,siempre lo hacen digestión sea exitosa o no y que deben
en un patrón muy específico, la cuidarse por que van desde un correcto
endonucleasa EcoRI permite tener manejo del material de laboratorio,
extremos cohesivos y la endonucleasa factores como pH, temperatura, nutrientes
HindIII extremos romos. en el caldo que permitirán el crecimiento
de las cepas, posteriormente
EcoRI solo produce un corte, mientras concentración de antibiótico y medio
que HindIII produce dos cortes, por lo cual adecuado para que se puedan
en la electroforesis (Fig 1) se observa este seleccionar a las células transformadas,
patrón D1 muestra una sola banda de para la extracción del plásmido, así como
9000 pb ya que fue donde se realizó la agregar la enzima RNasa para degradar
digestión simple con EcoRI, donde el DNA el RNA presente, la concentración de
sólo se linealizó, por lo cual se muestra sales en buffer, temperatura así como pH
este patrón de corrimiento que era el puesto que un aumento del pH de la
esperado fig 4. Mientras que cuando se reacción produce la ausencia de cationes
realizó la digestión simple con HindIII en monovalentes que provoca actividades
la electroforesis se observan las dos alternativas. Estos tres factores
bandas una de 6000 y otra 4000 pb, lo permitirán que las endonucleasas trabajen
que permite obtener dos fragmentos de de forma correcta en condiciones óptimas
menor tamaño que pueden migrar hacia el y así se obtenga la digestión esperada.
ánodo de forma distinta, corrimiento
esperado fig 6. Conclusiones
Al realizar una digestión con las dos
enzimas sobre el plásmido el resultado El uso de lisis alcalina es un método
son tres bandas, por los cortes que realiza eficaz en la purificación y aislamiento de
cada enzima que en total son 3, las DNA, lo cual se pudo corroborar con el
bandas tienen distintos tamaños debido al índice 260/280 y los resultados de
sitio donde corta cada enzima, por lo cual electroforesis en el cual no se observó
se muestra este patrón de corrimiento (D3 presencia importante de residuos de los
y D4 de la Fig 1) que era el esperado Fig reactivos usados durante el aislamiento o
8. por RNAsas. ASí, los resultados
mostraron un corte con EcoRI, dos cortes
Los cortes van a provocar que el DNA se con HindIII y tres con una mezcla de
enrolle en mayor o menor medida, esto ambos.
provoca diferentes corrimientos en el gel.
En esta electroforesis se puede apreciar Referencias
que Pl2 y Pl 4 muestran bandas no del
todo definidas esto porque no se puede ● Bancoadn. (2016). Programa de
realizar el corrimiento de forma adecuada control de calidad de muestras.
por que existe contaminación con Banco Nacional de ADN Carlos III:
proteínas que son más afines al cátodo lo Universidad de Salamanca. FO-
que justifica el punto anterior de la 00.03-2. Recuperado
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