Tema 4.

PROTEÍNAS

Tema 4.1. Aminóacidos y péptidos

Tema 4.2. Clasificación de proteínas, estructura y plegamiento
Tema 4.3. Procedimientos para la purificación y análisis de proteínas.

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 PROCEDIMIENTOS PARA EL ANÁLISIS DE PROTEÍNAS

1.- Extracción
Purificación de proteínas 2.- Precipitación selectiva
3.- Diálisis
4.- Cromatografías
4.1.- Gel filtración = tamizado molecular
4.2.- Intercambio iónico
4.3.- Afinidad
Secuenciación
4.4.- Otras
5.- Electroforesis: SDS-PAGE / IEF / 2D
Actividad e 6.- Western-blot
Estructura interacciones
7.- Estudios de estructura / secuenciación / actividad

Identificación
…

Objetivo de la purificación: aislar de forma selectiva una proteína para su estudio o utilización
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1. PRECIPITACIÓN SELECTIVA Y DIÁLISIS

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PRECIPITACIÓN SELECTIVA

Principio: Mientras unas proteínas precipitan en unas condiciones concretas, otras permanecen en disolución.

Factores que cambian la solubilidad de las proteínas:

a) Temperatura: se rompen los puentes de hidrógeno

b) Disolvente orgánico: hacen desaparecer las interacciones entre el agua y las cadenas laterales de aa
expuestos al exterior.

c) pH: Disminuye las interacciones electroestáticas. Si pH = pI → mínima solubilidad de la proteína

d) Fuerza iónica (μ): Si [sal] es baja, solubilidad es alta; si ↑↑ [sal], ↓ solubilidad.

Solubilidad

μ
e) Agentes caotrópicos (cloruro de guanidinio y urea) y detergentes: Según los casos puede ser reversible.

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PRECIPITACIÓN SELECTIVA PRECIPITACIÓN ISOELÉCTRICA

Relación solubilidad – pH

Ej: Lactoalbúmina

REPULSIÓN REPULSIÓN

Solubilidad (mg/ml)
pH < pI pH > pI

carga neta “+” Carga neta “-”

pH

Interacción de unas Agregación y

pH = pI proteínas con otras precipitación
carga neta “0” pH cercano a pI → ↓ solubilidad
↑↑ [sal] → ↓ solubilidad
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PRECIPITACIÓN SELECTIVA PRECIPITACIÓN CON SAL (fuerza iónica)

Relación solubilidad - fuerza iónica

CARACTERÍSTICAS DE LA TÉCNICA:
• Reversible (p. ej. a través de diálisis)
• Fácil y barata

Log solubilidad
[IONES] baja: se mantiene la capa de Cationes
solvatación, los iones impiden las Aniones
Agua
interacciones entre proteínas.
Proteínas están disueltas.

Fuerza iónica (I)

[IONES] alta: Los iones de la sal «secuestran» las

moléculas de agua (eliminación de la capa de
solvatación)  Proteínas interaccionan entre sí 
Precipitación

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PRECIPITACIÓN SELECTIVA PRECIPITACIÓN CON SAL (fuerza iónica)

Relación solubilidad - fuerza iónica

Precipitación de las proteínas del huevo con alta concentración de NaCl

Imagen: De Pozitron - Trabajo propio, CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=33565426 7

DIÁLISIS

• Proceso de purificación basado en el tamaño de las moléculas

• Para quitar moléculas pequeñas
• Para cambiar el tampón (ej. después de un «salting-out»)

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2. CROMATOGRAFÍAS

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CROMATOGRAFÍAS Generalidades

Las proteínas pueden diferenciarse entre ellas por la carga, hidrofobicidad, tamaño y grupos
funcionales. La cromatrografía en columna permite separar proteínas en base a las
características anteriores usando para ello resinas específicas dentro de la columna.

Fase estacionaria: resina o matriz

Fase móvil: solución tampón con la muestra de proteínas

Cromatógrafo 10
CROMATOGRAFÍAS
Cromatografía de tamizado molecular o de gel-filtración
Size Exclusion Chromatography or Gel-filtration chromatography

Las proteínas se separan en base a su tamaño

Matriz de perlas porosas de material
polimérico

Las moléculas más pequeñas quedan

más retenidas al introducirse por los
poros de la resina

Las moléculas grandes no quedan tan

retenidas y salen antes de la columna
Absorbancia
280 nm

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CROMATOGRAFÍAS
Cromatografía de tamizado molecular o de gel-filtración
Size Exclusion Chromatography or Gel-filtration chromatography

Vídeo

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CROMATOGRAFÍAS
Cromatografía de intercambio iónico Ion Exchange Chromatography

En un pH concreto, las proteínas se separan en base a su carga neta.

- DOS tipos de resina → DOS tipos de crom. Inter. iónico:

1. INTERCAMBIO ANIÓNICO  Resina (+)  Usada para

separar proteínas (-) (Ej. DEAE-Sepharose)

2. INTERCAMBIO CATIÓNICO  Resina (-)  Usada para

separar proteínas (+) (Ej. CM-Cellulose)

Si la proteína de interés tiene carga (+) y se usa una resina con carga (-), la proteína quedará retenida en la
columna. Se puede hacer soltar mediante un cambio de pH o variando la [sal] de la fase móvil.

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CROMATOGRAFÍAS
Cromatografía de intercambio iónico Ion Exchange Chromatography

Hay que tener en cuenta el pH de la fase móvil y el pI de la proteína:

- pH < pI  Proteína (+)
- pH > pI  Proteína (-)

Ejemplo: Proteína “x” con pI = 4,5

pI 4,5

H+ H+

1 14

• Si pH < 4,5 → proteína cargada (+) → la “alta” cantidad de protones desvían el equilibrio hacia la
unión de esos protones a la proteína.
• Si pH > 4,5 → proteína cargada (-) → la “baja” cantidad de protones desvían el equilibrio hacia la
desunión de esos protones a la proteína.
• Si pH = 4,5 → proteína con carga neta 0

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CROMATOGRAFÍAS
Cromatografía de intercambio iónico Ion Exchange Chromatography

Vídeo

Elución mediante cambio

de pH o fuerza iónica.

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CROMATOGRAFÍAS Cromatografía de afinidad Affinity chromatography

Separación de proteínas en base a la interacción específica a un ligando

Vídeo

Tipos de ligados unidos a la resina:

• Sustrato de un enzima, inhibidor, cofactor
• Anticuerpo
• Antígeno de un anticuerpo
• Receptor de una hormona
• Níquel
• Secuencia de ADN

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CROMATOGRAFÍAS Cromatografía de afinidad Affinity chromatography

Las proteínas se separan en base a su especificidad /afinidad por un ligando.

Ejemplo:
Purificación de proteína que se une a glucosa

Proteínas se une a la La glucosa libre

glucosa fijada a la añadida compite con la
matriz glucosa fijada
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CROMATOGRAFÍAS Cromatografía de afinidad Affinity chromatography

Ejemplo: cromatografía de immunoafinidad → Antígeno (Ag) – anticuerpo (Ab)

Ligando = Ab 18
3. ELECTROFORESIS

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ELECTROFORESIS

Basado en la separación de moléculas cargadas dentro de un campo eléctrico

- La movilidad electroforética de las moléculas (μ) guarda relación con la velocidad de las
partículas (V) y el potencial eléctrico (E).
- La movilidad electroforética también se expresa por el cociente entre la carga neta de la
partícula (Z) y el coeficiente de fricción (f):

μ = V/E = Z/f
(polo negativo)

(polo positivo)
Cátodo

Ánodo
-q
𝑭𝑹 𝑭

• Ventajas:
- Conocer el grado de pureza y cantidad
- Peso molecular aproximado
- Punto isoeléctrico
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ELECTROFORESIS SDS-PAGE
Sodium Dodecyl Sulfate PoliAcrylamide Gel Electrophoresis
Las proteínas se separan en base a su peso molecular

Condiciones desnaturalizantes

SDS: sodium dodecyl sulfate

1 - -
-
- -
- -
-
• Carga negativa - - -
- -
• 1 SDS/2aa → misma relación carga/masa - -
• Desnaturaliza la proteína - - - -
-

2 Β-mercaptoetanol → reduce (rompe) los puentes disulfuro

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ELECTROFORESIS SDS-PAGE

Efecto reductor del b-mercaptoetanol Rompe puentes S-S intra e intermoleculares

Acrilamida

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ELECTROFORESIS SDS-PAGE
Buffer de carga pH: 6.8
Stacking gel pH: 6.8 Electrophoresis buffer pH: 8.5

Stacking gel
(gel de empaqu...)

Running Gel
(Gel resolutivo)

Running gel pH: 8.5

Micelas detergente-proteína
- -
Buffer de carga (tampón de Laemmli): - - -
• Tris-HCl pH 6.8 - - - - Movilidad electroforética:
- - -
• SDS - - Solo depende del tamaño
• β-mercaptoetanol - - -
- - de la proteína, y no de la carga
• glicerol
- - - - eléctrica
• azul de bromofenol. - Proteína
- - SDS

En SDS-PAGE, las proteínas migran “from negative to positive” (segundo 8) 23

ELECTROFORESIS SDS-PAGE

Tinción de azul de
Coomassie

Tinción de plata

Marcador de peso molecular

(referencia)

24
ELECTROFORESIS SDS-PAGE
Estimación del peso molecular a través de SDS-PAGE

1 cm

3 cm

…
(distancia)
25
ELECTROFORESIS SDS-PAGE
Ejemplo: Detección de una proteína en los sucesivos pasos de purificación

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ELECTROFORESIS Isoelectroenfoque isoelectrofocusing

Las proteínas migran en base a su pI en un gel de agarosa que contiene un gradiente de pH.

27
ELECTROFORESIS Isoelectroenfoque isoelectrofocusing

STRIP HOLDER

STRIP (tiras de agarosa) 28

ELECTROFORESIS Electroforesis – 2D
ELECTROFORESIS 2D: SDS-PAGE + ISOELECTROENFOQUE

29
ELECTROFORESIS Electroforesis – 2D

Tinción de plata de un gel 2D 30

ELECTROFORESIS Western blot

1º Proteínas ya separadas por tamaño en SDS-PAGE

2º Transferencia del GEL a la membrana nitrocelulosa  Uso de la carga negativa

Ventajas del paso a membrana:

- Manipulación
- Tinción
- Sensibilidad
- Incubación anticuerpos
Tipos de membranas
- Nitrocelulosa
- Nylon
- PVDF

Entendiendo un Western blot (Javier Fdez)

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ELECTROFORESIS Western blot

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ELECTROFORESIS Western blot
Caso hipotético: un ratón WT y otro mutante para el gen E2F2 (E2F2-/-) se meten en la misma jaula y no se
sabe cuál es cuál.

El anticuerpo anti proteína

E2F2 detecta la proteína
en las muestras que sean
positivas para E2F2

La tinción de plata o La immunotinción (WB)

Coomassie no detectan detecta proteínas concretas
específicamente una
proteína concreta
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4. ESTUDIOS DE SECUENCIACIÓN,
ESTRUCTURA, ETC

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SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS
Frederick Sanger → Nobel de Química en 1958
por los trabajos de secuenciación de la insulina

Marcaje del N-terminal con dinitrofluorobenzeno (DNFB) y posterior hidrólisis en medio ácido. Se rompen
los enlaces peptídicos y se identifica el aminoácido marcado.

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SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS

Degradación Edman: se consiguen secuenciar automáticamente secuencias cortas

1. El primer aminoácido se marca y se libera consecutivamente

pH básico

pH ácido

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SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS

2. En cada ciclo se libera el aa marcado y se identifica por cromatografía

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MÉTODOS PARA DETERMINAR LA ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS
A) Difracción de rayos X

1- Cristalización de la proteína: todos los átomos permanecen en una posición concreta (todas las
proteínas adquieren una misma orientación )

2- Rayos X (longitud de onda 0,1 nm) irradian la muestra y difractan en diferentes direcciones,
según la disposición de los átomos de la molécula.

3- El patrón de difracción se trata matemáticamente para conseguir la disposición espacial de los

átomos y de ahí conseguir un modelo de estructura..

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MÉTODOS PARA DETERMINAR LA ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS
A) Difracción de rayos X

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MÉTODOS PARA DETERMINAR LA ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS
A) Difracción de rayos X

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MÉTODOS PARA DETERMINAR LA ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS
A) Difracción de rayos X

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MÉTODOS PARA DETERMINAR LA ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS
A) Difracción de rayos X

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MÉTODOS PARA DETERMINAR LA ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS

B) Otros métodos: 1- RMN (Resonancia magnética nuclear)

2- DC: Dicroismo circular
3- IR: Espectroscopia de infrarrojo
4- Cryo-EM: Crioelectromicroscopía

1 2 3

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MÉTODOS PARA DETERMINAR LA ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS

Cryo-EM
El desarrollo de la criomicroscopía electrónica simplifica y mejora la obtención de imágenes de
biomoléculas. La bioquímica ha entrado en una nueva fase gracias a este método: los investigadores
ahora pueden congelar el movimiento medio de las moléculas y visualizar procesos que nunca antes habían
visto, lo que resulta decisivo tanto para la comprensión básica de la vida química y para el desarrollo de
productos farmacéuticos. En 1990, Richard Henderson utilizó con éxito un microscopio electrónico para
generar una imagen en tres dimensiones de una proteína con resolución atómica; Joachim Frank consiguió
que esta tecnología fuera aplicable de forma general y Jacques Dubochet añadió agua al microscopio
electrónico y consiguió que las biomoléculas conservaran su forma natural incluso en el vacío.

Dubochet Frank Henderson

Nobel en Química
2017

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