Leidy Milena Garzón Guerrero, Diego Alejandro Ramírez Sandoval, Angie Daniela

Sanabria Jiménez
20161181013, 20161181027, 20152181016

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE LOWRY

FACULTAD DE MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES
PROYECTO CURRICULAR DE INGENIERÍA SANITARIA
BIOQUÍMICA

RESUMEN the pasta was determined. When cooking

Con ayuda del método de Lowry se
determinó la concentración de proteínas
solubles presentes en la pasta de cocina.
Al cocinar este alimento en el tiempo y
temperatura establecidos, se tomó el
líquido resultante de dicha cocción, luego
se procedió a realizar las diferentes
diluciones de las muestras patrón. Por
último se adiciona 1ml de reactivo de
Folin-Ciocalteau y se determinó la
absorbancia de las muestras con ayuda de
un espectrofotómetro. A partir de los
resultados obtenidos se calculó la
concentración de proteínas en la muestra
this food in the established time and
temperature, the liquid resulting from this
cooking was taken, then the different
dilutions of the standard samples were
made. Finally, 2 ml of Folin-Ciocalteau
reagent was added and the absorbance of
the samples was determined with the aid of
a spectrophotometer. From the results
obtained, the protein concentration in the
sample
Key words: Absorbance, Dilutions,
Proteins.
INTRODUCCIÓN

Palabras clave: Absorbancia, Diluciones Las proteínas son cadenas polipeptídicas,

Proteínas. según su conformación estas pueden
clasificarse en fibrosas y globulares. Las
ABSTRACT proteínas fibrosas poseen las cadenas
polipeptídicas ordenadas de modo paralelo
Using the Lowry method, the a lo largo de un eje, forman materiales
concentration of soluble proteins present in físicamente resistentes e insolubles en
agua, siendo elementos básicamente
estructurales como por ejemplo la α-
queratina del pelo, la fibroína de la seda o
el colágeno de los tendones. Por su parte,
las proteínas globulares, están constituidas
por una o varias cadenas polipeptídicas
plegadas de modo que puedan adoptar una
conformación esférica o globular.
OBJETIVOS
· Desarrollar y reconocer cómo se
debe llevar a cabo la cuantificación de
proteínas, debido que no solo se
utilizara en el laboratorio si no que a su
vez es un proceso que se aplica en
varias ramas que se enlazan con la
ingeniería sanitaria
· Determinar la concentración de
proteínas de la muestra problema de la
curva de calibración, en base a la
interpolación de los valores de
absorbancia
MARCO TEÓRICO
Las proteínas son cadenas polipeptídicas
que se diferencian de los oligopéptidos en
el número de aminoácidos que contienen,
en su carácter funcional y sobre todo en
que son el resultado del proceso de
expresión genética. La conformación de
una proteína hace referencia a la
disposición espacial de la misma, aspecto
de vital importancia, pues va a estar
directamente relacionado con la función
que desempeñan. Según su conformación
las proteínas pueden clasificarse en
fibrosas y globulares, desempeñando
diferentes funciones, como:
· Proteínas transportadoras
(mioglobina)
· Catalizadores (enzimas)
· Protectora (anticuerpos)
· Receptoras de señal (rodopsina)
· Reserva (albúmina)
Uno de los métodos empleados para la
determinación de proteínas es el método
de Lowry, este método Tiene la ventaja de
ser extremadamente sensible, capaz de
detectar cantidades del orden de 10
microgramos de proteína; su inconveniente
principal es que al evaluar fenoles
presentes en la proteína (esencialmente
residuos de tiroxina), la intensidad del
color resultante varía entre las distintas
proteínas. Pero cuando tratamos con
mezclas biológicas complejas, podemos
perfectamente calibrar el método con
alguna proteína comercial, como es la
seroalbúmina bovina.
La reacción que tiene lugar en el método
de Lowry es bastante compleja y no del
todo conocida. Se desarrolla en las
siguientes fases:
1. Reacción previa de la proteína en
medio alcalino con iones Cu2+ , en
presencia de tartrato para evitar la
precipitación. Es esencialmente
idéntica a la reacción del Biuret,
formándose un complejo de
coordinación entre el cobre y el
nitrógeno peptídico.
2. Reacción con el reactivo de Folin-
Ciocalteau para fenoles (ácido
fosfomolibdotungstico), que se reduce
por medio de los grupos fenol (y en
menor medida imidazol e indol)
presentes en la proteína a un complejo
de color azul oscuro, que se mide
colorimétricamente. El complejo
coloreado, cuya composición es
 desconocida, presenta dos máximos de
absorción a las longitudes de onda de
560 y 680 nm. La elección de una u
otra depende de la concentración
proteica de la muestra estudiada.
Reactivo de cobre: Tartrato de sodio-
potásio tetra-hidratado 0,278 g; Sulfato de
cobre penta-hidratado 6 mg; Hidróxido de
sodio 2 g; Carbonato de sodio deca-
hidratado 26 g

RESULTADOS

Imagen 1. Reacción entre la proteína y el reactivo

de Folin-Ciocalteau (Tomado de: Farmacia: la
ciencia del diseño de las formas farmacéuticas
2004.Michael E. Aulton)
Imagen 2. Preparación de las soluciones problema
MATERIALES Y REACTIVOS (Tomado por Angie Sanabria,2017)

MATERIALES: Solución Patrón Absorbancia

· 10 tubos de ensayo Albúmina (ml)
· 1 vasos de precipitado (300
1 0.038
mL)
· Balones aforados (250 mL) 3 0.066
· 2 pipetas (1, 5, 10 mL)
· 1 vidrio de reloj grandes 5 0.093
· 1 agitador de vidrio 7 0.147
· Gradilla
· Espectrofotómetro 8 0.448
· Celdas Tabla 1. Datos de la absorbancia de la Solución
· Agua destilada patrón.(Datos Tomados del grupo 3 )

MATERIAL DE PRUEBA:
· pastas comerciales

REACTIVOS:

Reactivo de Folin-Ciocalteau: diluido

(MERCK ART 9001). A 6,25 mL del
reactivo concentrado, adicionar 10 mL de Gráfica 1. Curva de CalibracionSolucionPatron.
agua destilada.
Al momento de realizar la curva de
calibración de la solución patrón
(Albúmina) podemos ver que tiene un R2
de 0.9878

Gráfica 2. Curva de CalibraciónSolución

Problema (Pasta Fideos).

Al momento de realizar la curva de

calibración de la solución Problema (Pasta
Fideos) podemos ver que tiene un R2 de
Imagen 2. Preparación de las disoluciones 0.9878.
problema (Pasta de Fideos, Tomado por Angie
Sanabria, 2017)
Solución Problema Absorbancia
(Pasta Espagueti) (ml)

1 0.070

3 0.078

5 0.125

7 0.156

9 0.203
Ima Tabla 3. Datos de la absorbancia de la Solución
gen 3. Preparación de las disoluciones problema patrón.(Datos tomados por Milena Garzón)
(Pasta de Fideos más reactivo de Cobre y reactivo
de Folin-Ciocalteau, Tomado por Angie Sanabria,
2017)

Solución Problema Absorbancia

(Pasta Fideos) (ml)

1 0.066

3 0.077

5 0.095

7 0.96 Gráfica 3. Curva de CalibraciónSolución

Problema (Pasta Espagueti).
8 0.97
Tabla 2. Datos de la absorbancia de la Solución
patrón.(Datos tomados por los Autores)
Al momento de realizar la curva de
calibración de la solución Problema (Pasta
Espagueti) podemos ver que tiene un R2 de
1 amoniaco.
ANÁLISIS DE RESULTADOS
El método de Biuret comprende un ensayo
colorimétrico de un paso en donde se
cuantifica la formación de un complejo
estable entre las proteínas que existen en la
muestra problema y el cobre (II). Se
fundamente en la formación de un
compuesto azul violeta que se da por la
reacción del ion cúprico con la proteína en
medio alcalino, se puede observar a 310
nm o 540-560 nm, se produce por la
coordinación de un átomo de cobre con
cuatro átomos de nitrógeno. Este ion
forma un enlace covalente coordinado. Se
basa en la formación de un complejo
coloreado entre e4l Cu2+ y los grupos NH
de los enlaces pepiticos en medio básico.
1Cu2+ se acompleja con 4 NH.
Figura 1. Determinación cuantitativa de proteínas
(reaccion de Biuret)
El complejo se basa en la desprotonación
de los grupos amida para formar el enlace
en el cobre (II) o por el establecimiento de
un enlace coordinado entre el metal y los
pares de electrones libres de los átomos de
oxigeno y de nitrógeno del péptido.
Después de la adición del reactivo de
cobre se requiere de tiempo para
desarrollar una coloración de Biuret
estable; es necesario considerar la posible
influencia de aminoácidos libres que
forman buffer en configuración tris y
El color formado responde a la ley de
Lambert y Beer, por lo tanto es posible la
cuantificación de las proteínas presentes en
las muestras desconocidas, mediante la
comparación de la absorbencia de la
muestra con la de los patrones de
concentración conocidos.
La intensidad de la coloración es
directamente proporcional a la cantidad de
proteínas (enlaces pepiticos) y la reacción
es bastante especifica, de manera que
pocas sustancias interfieren.
Para la medición de la observancia se hizo
el uso del espectrofotómetro. La celda
permite que ocurra el fenómeno de
reflexión de luz, la absorbencia obtenida
por la muestra se comparo con una celda
con agua destilada que funciona como
blanco y con una muestra patrón en
nuestro caso albumina.
Si las muestras cumplen con la ley de Beer
y Lambert la cual dice que la cantidad de
luz absorbida por una muestra es
directamente proporcional a la
concentración de la misma, es decir que a
mayor concentración mayor es la
absorción y menor es la transmisión y
también es proporcional a la longitud del
cuerpo atravesado por el haz (ancho de la
celda). Se pudo determinar la
concentración de la proteína en las
diferentes muestras de pasta.
La ley de Beer plantea que cuando un rayo
de luz pasa a través del medio absorbente,
su intensidad disminuye a medida que la
concentración del medio absorbente
aumenta, es decir que cuando hay mayor
absorción por parte de la solución esta es
directamente proporcional a su
concentración; de igual forma cuando el
numero de moléculas aumenta a sí mismo espectrofotometría y la variable
es la interacción de la luz con ellas, determinada en ese caso en la
además cuando la distancia qué recorre la concentración proteica.
luz por la muestra es mayor, mas
moléculas la absorberán. BIBLIOGRAFIA:
La absorbencia de un soluto depende
linealmente de la concentración y por
consiguiente la espectrofotometría de
absorción es ideal para hacer mediciones
cuantitativas. La longitud de absorción y la
fuerza de absorbencia de una molécula no
solo dependen de la naturaleza química
sino del ambiente molecular en donde se
encuentre el cromoforo. La
espectrofotometría de absorción es por
tanto una excelente técnica para seguir las
reacciones de unión, catálisis enzimáticas
y transiciones conformacionales en
proteínas y ácidos nucleídos. (Quesada
Mora, S. 2007)

CONCLUSION:
Para el análisis cuantitativo de proteínas
existen técnicas que permiten obtener el
contenido proteico de una muestra
determinada. En base a las propiedades
que caracterizan a las proteínas, el método
de Biuret es bastante útil para
caracterizarlas, esta solución reacciona con
los enlaces petidicos dando un color
Violeta haciendo referencia a su vez a la
ley de Beer y Lambert. La prueba de
Biuret puede determinar la concentración
de proteína contenida en una o varias
muestras que se obtiene al relacionar los
valores de la absorbencia en una curva
patrón que se elabora a partir de la
concentración de la proteína conocida, en
este caso la albumina.
La curva patrón realizada en los resultados
permite medir la concentración de las
sustancias empleadas, se basa en la
existencia de una relación lineal en la
absorbencia obtenida por el método de
CIBERGRAFÍA
· Jerarquía estructural de las proteínas.
Arboledas D. [En línea] disponible
en:https://books.google.com.co/books?
id=DPXMWL4erW0C&printsec=front
cover&dq=prote
%C3%ADnas&hl=es&sa=X&ved=0ah
UKEwjgwNCoyd7TAhXC4SYKHcjT
B5wQ6AEIKTAB#v=onepage&q=pro
te%C3%ADnas&f=false
· Farmacia: la ciencia del diseño
de las formas farmacéuticas
2004.Michael E. Aulton [En línea]
disponible
en:https://books.google.com.co/books?
id=r5k1fvgCi7IC&pg=PA36&dq=Low
ry-1+
(Farmacia)&hl=es&sa=X&ved=0ahU
KEwiWtqiYxd7TAhWDSSYKHR-
rBDsQ6AEIJTAA#v=onepage&q=Lo
wry-1%20(Farmacia)&f=false