INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS
BIOQUIMICA GENERAL
LABORATORIO DE BIOQUIMICA
GRUPO 4QM2
PRACTICA 3. PRECIPITACION,
SEPARACION Y PUNTO
ISOELECTRICO DE PROTEINAS.
ALUMNOS:
CRUZ CORTES BLANCA ESTELA
GONZALEZ VARGAS ITZEBEL
MONTSERRAT
SECCION: 3
INTRODUCCION
Las proteínas son macromoléculas
poliméricas formadas por aminoácidos.
Se sintetizan en los ribosomas por
traducción de las moléculas de ácido
ribonucleico (ARN) mensajero (ARNm),
utilizando el código genético y ARN de
transferencia (ARNt). El ensamblaje de
los aminoácidos para formar las
proteínas se realiza mediante enlace
peptídico, por lo que la cadena
polipeptídica se sintetiza ensamblando
aminoácidos en el extremo con el grupo
carboxilo libre (C-terminal) de la cadena
de aminoácidos, quedando el extremo N-
terminal con el grupo amino libre. Según
el número de aminoácidos, las cadenas
de aminoácidos pueden clasificarse en
oligopéptidos (menos de 10
aminoácidos), polipéptidos (entre 10 y
100) y proteínas (más de 100).
Las proteínas son solubles en agua
cuando adoptan una conformación
globular. La solubilidad es debida a los
radicales (-R) libres de los aminoácidos
que, al ionizarse, establecen enlaces
débiles (puentes de hidrógeno) con las
moléculas de agua. Así, cuando una
proteina se solubiliza queda recubierta
de una capa de moléculas de agua (capa
de solvatación) que impide que se pueda
unir a otras proteinas lo cual provocaría
su precipitación (insolubilización). Esta
propiedad es la que hace posible la
hidratación de los tejidos de los seres
vivos.
Los aminoácidos son moléculas
anfóteras, es decir, e disolución acuosa
pueden comportarse como ácidos y
como bases. En general a pH ácido los
aminoácidos se encuentran
mayoritariamente en forma de catión
(protonado), y a pH básico se encuentran
en forma de anión (desprotonado).
Cuando el pH es igual al punto
isoeléctrico, el grupo carboxilo se
desprotona formándose el anión
carboxilo (-COO- ), y el grupo amino se
protona (-NH3 + ), formándose el catión
amonio. Esta forma dipolar neutra (carga
formal cero) se conoce como zwitterión.
Los principales factores ambientales que
influyen en la solubilidad de una proteína
son los siguientes: (1) la temperatura; (2)
la constante dieléctrica del medio; (3) el
pH del mismo; y (4) la fuerza iónica.
las proteínas requieren algo de sal para
entrar en solución (fenómeno de “salting-
in”) y son precipitadas por
concentraciones relativamente elevadas
de sales (fenómeno de “saltingout”). Sin
embargo, la respuesta de las diferentes
proteínas no es uniforme;
concentraciones salinas que hacen
precipitar a unas dejan en solución a
otras.
Una proteína se desplegará; es decir, se
desnaturalizará cada vez más cuanto
más se aleje por encima o por debajo de
su punto isoeléctrico. Bajo condiciones
más ácidas, las proteínas tienen carga
más positiva, lo cual es una
consideración importante para muchas
bebidas. La carga se hace más negativa
a medida que el pH de la solución
aumenta.
La insulina humana es una hormona de
naturaleza proteica. Se sintetiza en las
células beta de los islotes de Langerhans
del páncreas. La insulina es secretada
en respuesta a la hiperglucemia y
también ante algunas hormonas
peptídicas como glucagón,
colecistoquinina-pancreozimina y
secretina. Sus acciones principales son
estimular la captación de glucosa en
varios tipos de células, y disminuir el
nivel de glucosa sanguínea, al estimular
la conversión de glucosa en glucógeno
en los hepatocitos y miocitos, siempre
que aumente dicho nivel.
En el desarrollo de la práctica se
realizarán los siguientes ensayos:
1. Separación de Proteínas por
Precipitación con Sales (Salting
out). El salting in es el fenómeno
por el cual la concentración de sal
aumenta la solubilidad de la
proteína. A altas fuerzas iónicas,
la solubilidad de las proteínas
disminuye.
2. Precipitación por efecto del pH y
solventes. Se fundamenta con el
Punto Isoeléctrico, el cual es el
valor de pH en el cual la carga
neta de la proteína es cero y no
migra en un campo eléctrico.
3. Precipitación por metales
pesados. Las proteínas precipitan
de sus soluciones por algunos
tipos de metales pesados como
cloruro de mercurio, nitrato de
plata, sulfato de cobre, etc.
4. Determinación del punto
isoeléctrico de la insulina.
OBJETIVOS
OBJETIVOS DE LA PRACTICA
 Modificar algunos factores
extrínsecos y analizar su efecto
sobre la solubilidad de proteínas.
 Determinar el punto isoeléctrico
de la insulina basándose en sus
propiedades de solubilidad a
diferentes pH.
OBJETIVOS REDACTADOS POR
NOSOTROS
 Realizar observaciones de cada
ensayo realizado (precipitación
con sales, precipitación por efecto
del pH y de solventes, y
precipitación por metales
pesados).
 Determinar el punto isoeléctrico
de la insulina por medio de las
observaciones y cálculos de la
ecuación de Henderson-
Hasselbach.
RESULTADOS
I. Separación de Proteínas por
Precipitación con Sales
(Salting Out).
Tabla 1. Resultados del Salting-out.
MUESTRA BIURET INTERPRETACIÓN
Precipitado 2 + Presencia de
proteínas
Sobrenadante 2 + Presencia de
proteínas
Imagen 1. En esta imagen se muestra el
precipitado 2 negativo, sin embargo, se
agregó después más reactivo de Biuret y
dio positivo.

II. Precipitación por Efecto del pH Y de

Solventes
Tabla 2. Precipitación por Efecto Del pH
y Solventes.
Imagen 3. Se muestran los resultados de
Tubo 1 2 3 4 los tubos después de los 3 ml de Etanol
Observacion Turbi Sin Turbio Turbio
es o cambio blanqueci blanqueci al 96°.
s no no
Observacion + - + +
es

Imagen 2. Se muestran los resultados de

los tubos antes de los 3 ml de Etanol al
96°.

II. Precipitación por Metales

Pesados.

Tabla 3. Precipitación por metales

pesados.

Tub 1 2 3 4 5 6
o
Interpre + + + / - +
tación
Observ Precip Precip Precip / Tur Precip
aciones itación itacion itacion bide itacion
z
Imagen 4. Se muestran los resultados de
los tubos para precipitación por metales
Tubo No.1
pesados.
Ácido acético
(0.2M/0.2M) (0.23mL) = [0.23]
Acetato de Sodio
(0.2M/0.2M) (0.02mL) = [0.02]
pH= 4.74 + log [0.02]/ [0.23]= 3.67
Tubo No.2
Ácido acético
(0.2M/0.2M) (0.15mL) = [0.15]
Acetato de Sodio
(0.2M/0.2M) (0.10mL) = [0.1]
pH= 4.74 + log [0.1]/ [0.15]= 4.56
Tubo No. 3
Ácido acético
(0.2M/0.2M) (0.05mL) = [0.05]
Acetato de Sodio
Imagen 5. Se muestran los resultados de
los tubos para precipitación por metales (0.2M/0.2M) (0.20mL) = [0.20]
pesados. NOTA. No se realizó el tubo 4,
pH= 4.74 + log [0.2]/ [0.05]= 5.34
debido a que no había cloruro de bario.
Tubo No. 4
Ácido acético
(0.2M/0.2M) (0.01mL) = [0.01]
Acetato de Sodio
(0.2M/0.2M) (0.24mL) = [0.24]
pH= 4.74 + log [0.24]/ [0.01]= 6.12
Tubo No. 5
Ácido acético
IV.- Determinación del Punto Isoeléctrico (0.2M/0.2M) (0.00mL) = [0.0]
de la Insulina
Acetato de Sodio
Tabla 4. Determinación del Punto
Isoeléctrico de la Insulina. (0.2M/0.2M) (0.25mL) = [0.25]
pH= 4.74 + log [0.25]/ [0.0]= /
Tubo 1 2 3 4 5
Observaciones - - + - - Por lo tanto, el punto isoeléctrico de la
pH insulina es de 5.34.
Imagen 6. Resultados de la
determinación del Punto Isoeléctrico de
la Insulina.
Imagen 7. Resultados de la
determinación del Punto Isoeléctrico de
la Insulina.
DISCUSIONES
Se realizaron 4 diferentes
procedimientos, 3 para modificar algunos
factores intrínsecos como la fuerza
iónica, el pH, la constante dieléctrica, y
analizar su efecto sobre la solubilidad de
las proteínas. Y otro para determinar el
punto isoeléctrico de la insulina,
basándose en sus propiedades de
diferentes valores de pH.
Para la preparación de proteínas por
precipitación con sales (Salting Out), se
pudo observar de manera más segura
que había presencia o ausencia de
proteínas con ayuda del reactivo de
Biuret ya que este reactivo se caracteriza
por indica la presencia de proteínas,
péptidos cortos y otros compuestos con
dos o más enlaces peptídicos en
sustancias de composición desconocida
(Alves, s. f.).
Las proteínas que tiene la clara de
huevo, se usan en nuestro organismo
para crear nuevas proteínas,
responsables de diferentes funciones.
Las proteínas de este alimento
perteneciente a la categoría de de los
huevos, están formadas por aminoácidos
como ácido aspártico, ácido glutámico,
alanina, arginina, cistina, fenilalanina,
glicina, histidina, isoleucina, leucina,
lisina, metionina, prolina, serina, tirosina,
treonina, triptofano y valina. Estos
aminoácidos se combinan para formar
las proteínas de la clara de huevo
(COMPOSICIÓN NUTRICIONAL DEL HUEVO,
s. f.).
En la precipitación de pH y solventes se
observa que el tubo 2 fue el único que no
presento precipitado, esto tubo contenía
la clara de huevo con NaOH, aquí la
proteína se solubilizo, por lo que estaba
lejos del PI.
En la precipitación por metales pesados,
observamos que solo el 4 no precipito,
solo hubo turbidez Este fue de Cloruro
de Sodio con la clara de huevo, sin
embargo, esta tuvo que habernos dado
negativa debido a que solubilizaron a la
proteína presentándose el fenómeno de
Salting in, debido a que hubo una
interacción entre la proteína y los iones
de la sal. Mientras que los demás dieron
positivo, precipitando, a que al haber COMPOSICIÓN NUTRICIONAL DEL
iones positivos y negativos que HUEVO. (s. f.). Recuperado 24 de marzo
interactúen con las moléculas de agua, de 2023, de
se pierde la interacción proteína-agua https://www.institutohuevo.com/composic
(Xiong et al., 2018). ion-nutricional-del-huevo/
En el punto isoeléctrico de la insulina, la Robert, T. (2018). ELABORACIÓN DE
turbidez indica la presencia del punto GUIONES PARA EL ESTUDIO
isoeléctrico (Robert, 2018), debido a la INTERACTIVO DE LA RELACIÓN
formación de un precipitado, este se ESTRUCTURA-FUNCIÓN DE
presentó en el tubo 3. PROTEÍNAS. UNIVERSIDAD DE
SALAMANCA. Recuperado 24 de marzo
CONCLUSIONES de 2023, de
 Las sales neutras con fuerzas http://proteinasestructurafuncion.usal.es/
iónicas muy altas disminuyen la moleculas/Insulina/index.html
solubilidad de las proteínas.
 La proteína presento un PI en
donde la carga neta de la
proteína fue 0, y presento su
mayor viscosidad
 Los metales pesados precipitan a
las proteínas.
 El PI de la insulina es de
aproximadamente de 5.34
BIBLIOGRAFIA
Xiong, S., Lorenzen, K., Couzens, A. L.,
Templeton, C. M., Rajendran, D., Mao,
D. Y., Juang, Y., Chiovitti, D., Kurinov, I.,
Guettler, S., Gingras, A., & Sicheri, F.
(2018b). Structural Basis for Auto-
Inhibition of the NDR1 Kinase Domain by
an Atypically Long Activation Segment.
Structure, 26(8), Determinación del punto
isoeléctrico de las proteínas presentes
en cuatro fuentes foliares: yuca (Manihot
esculenta Crantz) variedades verónica y
tai, jatropha (Jatropha curcas L.) y
gmelina (Gmelina arbórea).
https://doi.org/10.1016/j.str.2018.05.014
Alves, M. O. O. B. / /-. (s. f.). Reacción
de Biuret. DeCS. Recuperado 24 de
marzo de 2023, de
https://decs.bvsalud.org/es/ths/resource/
?id=1763