Técnicas

Purificación de
Proteínas
Carrera de Química y Farmacia
magdalena.cortes@uv.cl
✓ Las proteínas se presentan en una gran
variedad de tamaño: péptidos a polímeros
enormes de masas moleculares hasta del
orden de millones
✓ Las proteínas cumplen diversidad de
funciones
✓ Lo que resulta más sorprendente es que las
células pueden producir proteínas con
propiedades y actividades muy diferentes
uniendo los 20 aminoácidos en secuencias
diferentes
➢ Una proteína típica nace
en el momento de la
traducción, madura a
través de eventos de
procesamiento

➢ postraduccional, alterna
entre estados de trabajo
y de reposo, envejece
(oxidación,
desamidación, etc.,) y
muere cuando se
degrada hacia los
aminoácidos que la
componen.
Ciclo de vida de una proteína hipotética

. 1) síntesis en un ribosoma de una cadena

polipeptídica

2) empieza a plegarse hacia su

conformación natural (azul).

3) El plegamiento puede acompañarse de

división proteolítica o la formación de
enlaces disulfuro (S—S).

4) las modificaciones covalentes, por

ejemplo, fijar una molécula de ácido graso
(color amarillo)

5) translocación de la proteína modificada

hacia una membrana.

6) la unión de un efector alostérico (color

rojo) puede desencadenar conformación
catalíticamente activa.

7) con el tiempo, las proteínas quedan

dañadas por desamidación o
desnaturalización

8) pueden ser “marcadas” mediante la

fijación covalente de ubiquitina (Ub).

9) la proteína ubiquitinada después es

degradada a los aminoácidos
Las proteínas y los péptidos se deben
aislar y purificas antes de analizar
Obtención extracto crudo

1.Selección de la fuente de proteína.

2.Métodos de solubilización.
3.Estabilización de las proteínas.
4.Determinación de las proteínas.
5.Estrategia general en la purificación de
proteínas.
 AISLAMIENTO DE PROTEÍNA
1.- Selección fuente de proteína FUENTES:
• Vegetal
• Animal
• Microorganismos

¿Qué debo tener en

consideración?
• Fácil obtención.
• Cantidad de proteína
suficiente en el tejido.
• Propiedades especificas
de proteína que ayuden en
su estabilización y
aislamiento

Qué sé?
Las células contienen miles de proteínas diferentes,
cada una en cantidades ampliamente variables.
 AISLAMIENTO DE PROTEÍNA
2.- Métodos de solubilización
✓ localización de proteína en la célula.
• Ej.: Citosol → Lisis osmótica. (Célula animal)
• ¿Células vegetales ? → lisozima, detergentes
o disolventes orgánicos.
• ¿microorganismos ? → lisozima
• Ruptura mecánica:

Ej.: Mitocondria → Centrifugación

diferencial
 AISLAMIENTO DE PROTEÍNA
3.- Estabilización de las proteínas

• pH → soluciones tampón
• Temperatura
• Enzimas → proteasas → pH y T°
• Oxidación
• Metales pesados → Unión irreversible
• Concentración salina
• Polaridad de la disolución
• Microorganismos
 AISLAMIENTO DE PROTEÍNA
4.- Determinación de proteínas
Técnicas
inmunoquímicas
sensibilidad y
discriminación elevada.
Trabajar con
proteínas
Obtención 5.- Purificación
extracto crudo de proteína
• Propiedades
• Selección de la fuente de fisicoquímicas Lo veremos
proteína. de las en lab. N°2
• Métodos de proteínas:
solubilización. • Solubilidad
• Estabilización de las • Carga iónica
proteínas. • Tamaño
• Determinación de las molecular
proteínas. • Propiedades
• Estrategia general en la absorción
purificación de • Unión a otras
proteínas. moléculas
biológicas
 SOLUBILIDAD DE LAS
PROTEÍNAS
➢Efecto de las concentraciones salinas.
➢Efectos de los disolventes orgánicos
➢Efectos del pH
➢Cristalización. Ácido

Base
 Efecto de las concentraciones salinas

• La solubilidad de una proteína

cuando la fuerza iónica es
pequeña aumenta, en general,
con la concentración de la sal.
(SALTING IN)
• Cuando la fuerza iónica es mayor
por aumento de la
concentración de sal, la
solubilidad de la proteína
disminuye. (SALTING OUT)
Salting in:
• Interacción de los iones de la sal con los
grupos iónicos de las proteínas.
• Disminución de interacción entre
proteínas.
• Aumento de solubilidad.
Salting out ¿?
 Efectos de los disolventes orgánicos
• “Semejante disuelve Semejante”
• Agua→ Alta constante dieléctrica
• Acetona y etanol → Bajas constantes dieléctricas
• ¿ De qué depende solubilidad de proteína?
 Precipitación con disolventes orgánicos
• Disminución poder de solvatación → Precipitación.
• OJO!: si se desea utilizar este método se debe utilizar T°
cercana a 0° para evitar la desnaturalización de nuestra
proteína.
 Efectos del pH
• Punto isoeléctrico → ¿cómo es su
solubilidad? → ¿influye
positivamente la concentración sal en
la solubilidad?
• Carga neta → ¿qué sucede al
aumentar el pH?
❑ Son métodos más potentes, que
aprovecha las diferencias de
carga, tamaño, afinidad de
unión, entre otras propiedades.

❑ Fase estacionaria (material

poroso). Fase móvil (solución
tamponada).

❑ Tipos: cromatografía de
intercambio catiónico, de
exclusión molecular, de afinidad,
liquida de alta resolución (HPLC)
SEPARACIONES
CROMATOGRÁFICAS
➢C r o m a t o g r a f í a d e i n t e r c a m b i o i ó n i c o .
➢C r o m a t o g r a f í a s o b r e p a p e l .
➢C r o m a t o g r a f í a d e f i l t r a c i ó n p o r g e l .
➢C r o m a t o g r a f í a d e a f i n i d a d .
CROMATOGRAFÍA INTERCAMBIO IÓNICO
 C R O M AT O G R A F Í A
INTERCAMBIO
IÓNICO

• Fase móvil → disolución

• Fase estacionaria → matriz
• Matriz→ resina con grupos
cargados.
• Intercambiadores catiónicos
• Intercambiadores aniónicos.
• Influye pH y [sales]
• Separación por ¿?
• CARGAS
Interpretación: Si comienzo con 10.000 proteínas que son enzimas en la muestra
original, tengo mucha actividad enzimática, pero estas actúan sobre distintos sustratos,
por lo tanto tengo poca especificidad (o actividad específica).
→ A medida que voy purificando cada vez tengo menos muestra y llego a tener sólo
3 enzimas y por tanto, tengo poca actividad. Pero estas 3 enzimas actúan sobre el
mismo sustrato, por lo tanto aumentó la actividad específica.