Ejercicios Cinética Enzimática

Facultad de Ingeniería
Carrea de Ingeniería en Biotecnología
Nombre: Ana Angulo Pozo

Asignatura: Enzimología

1. La enzima Invertasa cataliza la hidrólisis de Sacarosa a fructosa y glucosa. Esta

enzima tiene un Km = 0.5 mM para sacarosa y una constante catalítica (K cat) igual a
175 min-1. Se mide su actividad en presencia de 0.25 mM de sacarosa con 25 x 10 -
6
µmol de enzima.
a) ¿Qué velocidad de catálisis se observará (Vo) en estas condiciones?
Vmáx
K cat = K × [ E ] =Vmáx
[ E ] cat
−1 −6 −3 μmol
Vmáx=175 min × 25× 10 μmol=4,375× 10
min

−3 μmol
4,375× 10 × 0 , 25 mM
Vmáx ×[S ] min μmol
Vo= = =1,458× 10−3
Km+[S] 0 ,5 mM + 0 , 25 mM min

b) ¿Qué fracción representa esto de la Vmáx?

[S] Vo [S] 0 ,25 mM 1
Vo= ×Vmáx = = =
Km+ [ S ] Vmáx Km+ [ S ] 0 , 5 mM +0 , 25 mM 3

c) ¿Cuánto sustrato habría que añadir para que la velocidad observada alcance
95% de la Vmáx?
0 , 33 0 , 25 mM 0 , 95(0 , 25 mM )
x= =0 , 72 mM
0 , 95 x 0 ,33

d) ¿Qué importancia podría tener esto para la posible aplicación industrial de

la enzima? - Explique sus respuestas.
Esta enzima al ser hidrolasa, que quiere decir que disocia azucares puede ser usada en
la industria alimenticia, o por otro lado puede utilizarse para la producción del ácido
cítrico, siempre y cuando se mezcle con otro tipo de enzimas.

2. La actividad de la Acetil-CoA carboxilasa, medida con tres diferentes

concentraciones de enzima y a tres diferentes concentraciones de sustrato fue
la siguiente:

[Enzima] (µg de proteína) [Enzima] (µg de proteína)

 0.1 0.2 0.5 0,1 0,2 0,5
1/
[AcetilCoA
Velocidad (µmol / min) [AcetilCoA] 1/Velocidad (µmol / min)
] (µM) ¯
(µM) ¯
0,05 0,28 0,55 1,37 20,00 3,64 1,83 0,73
0,14 0,48 1,00 2,50 7,14 2,07 1,00 0,40
0,23 0,58 1,19 2,89 4,35 1,72 0,84 0,35
0,32 0,64 1,39 3,46 3,13 1,56 0,72 0,29
0,50 0,76 1,49 3,66 2,00 1,32 0,67 0,27
0,59 0,77 1,50 3,81 1,69 1,31 0,67 0,26

a) Calcular para cada uno de los tres experimentos el valor de Km y el valor de

Vmáx.
4.000
1/Velocidad (µmol / min) vs 1/[AcetilCoA]
3.500
(µM)
f(x) = 0.126306305475122 x + 1.13065649129169
R² = 0.99737263664147 [enzima]= 0.1
3.000
1/Velocidad (µmol / min)

2.500
[enzima]= 0.2
2.000
f(x) = 0.0642766508543744 x + 0.545212683293329
1.500 R² = 0.998813141543636

1.000 [enzima]= 0.5

0.500 f(x) = 0.0253878819505842 x + 0.221007604726011

R² = 0.997713201432659
0.000
0.000 5.000 10.000 15.000 20.000 25.000
1/[AcetilCoA] (µM)

Km 1 1
m= m ×Vmáx=Kmb= Vmáx=
Vmáx Vmáx b

Cuando [enzima]= Cuando [enzima]= Cuando [enzima]=

0.1 0.2 0.5
m= 0,13 m= 0,06 m= 0,02
b= 1,13 b= 0,55 b= 0,22
b=1/Vmáx b=1/ Vmáx b=1/ Vmáx
Vmáx =1/b Vmáx =1/b Vmáx =1/b
Vmáx = 0,88 Vmáx = 1,83 Vmáx = 4,52
m=km/ Vmáx m=km/ Vmáx m=km/ Vmáx
km=m * Vmáx km=m * Vmáx km=m *Vmáx
km= 0,112 km= 0,118 km= 0,115

b) ¿Son los valores de Km y Vmáx iguales o diferentes?

Los valores de Vmáx son muy distintos, debido que el producto formado tiene grandes
variaciones, en cambio los valores de Km son muy similares ya que la concentración de
enzima no varía demasiado.

c) Explique si lo que observó es lo que esperaba obtener.

Si esperaba conseguir estos resultados, y si tienen lógica; ya que cuando aumenta la

concentración de enzima la velocidad máxima es más alta y eso es justamente lo que
se demostró.

d) Sabiendo que la enzima pesa 220000 gr/mol, haga una gráfica de Vmáx
vs µmol de enzima total.
μmol −7 μmol −7
0 , 1 μg × =4,545× 10 μmol0 , 2 μg × =9,091× 10 μmol
220000 μg 220000 μg
μmol −6
0 , 5 μg × =2,273× 10 μmol
220000 μg

Vmáx ( µmol/min) µmol

0,88 4,545E-07
1,83 9,091E-07
4,52 2,273E-06

Vmáx vs [enzima]
5
4.5
4 f(x) = 1995452.07301015 x − 0.00428987854727714
R² = 0.999864450222643
Vmax (µmol / min)

3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
0.000E+00 5.000E-07 1.000E-06 1.500E-06 2.000E-06 2.500E-06
[enzima] (µmol)

e) ¿Qué representa la pendiente de esta gráfica? (Vmáx / [ET])

La pendiente de esta gráfica representa la Kcat, porque es la relación de la velocidad
máxima con el total de la enzima.

f) ¿En qué se parece el valor anterior a la Actividad específica = Vmáx/[E T]?

Se parece a que las dos representa la Kcat de los distintos experimentos

3. Se realizaron estudios de inhibición para dos enzimas diferentes presentes en el

suero bovino. Se varió la concentración de sustrato a en ausencia y en presencia
de tres concentraciones diferentes de inhibidores de cada enzima. En cada caso
encontrar:
a) El valor de Km y Vmáx.
b) El tipo de inhibición.
c) El valor de Ki para el inhibidor.

1. Enzima: Fosfatasa alcalina de suero bovino, inhibidor: Oxalato de

Bromolevamisol
[Bromolevamisol] (µM) [Bromolevamisol] (µM)
0 8 16 40 0 8 16 40
1/
[Sustrato Velocida de iniciales (µmol [Sustrato] 1/Velocida de iniciales (µmol
](mM) min-1 mgProt.-1) (mM) min-1 mgProt.-1)
0,10 0,23 0,21 0,19 0,16 10,00 4,33 4,76 5,24 6,33
0,30 0,43 0,37 0,31 0,24 3,33 2,32 2,71 3,24 4,18
0,70 0,61 0,49 0,43 0,28 1,43 1,65 2,05 2,35 3,61
1,30 0,75 0,60 0,47 0,30 0,77 1,33 1,67 2,14 3,29
1,80 0,81 0,66 0,53 0,32 0,56 1,23 1,52 1,89 3,13
2,60 0,91 0,66 0,55 0,33 0,38 1,10 1,52 1,83 3,05
4,10 0,96 0,69 0,56 0,35 0,24 1,04 1,45 1,78 2,85
5,80 0,98 0,74 0,56 0,34 0,17 1,02 1,35 1,79 2,91

a) El valor de Km y Vmáx
1 Km 1 1 1 1 Km
= × + b= Vmáx= m= Km=Vmáx × m
Vo Vmáx [ S ] Vmáx Vmáx b Vmáx

Cuando [E]=0
m= 0,3349
b= 1,046
Vmáx= 0,956µmol/
min
Km= 0,32

b) El tipo de inhibición.
Es una inhibición incompetitiva ya que su pendiente se mantiene constante y la
velocidad se ve afectada.

Tipo de inhibición
7.000

6.000 f(x) = 0.344283533218011 x + 2.94227777964594

R² = 0.990350776654396
5.000 f(x) = 0.354556751458091 x + 1.7839295471149
R² ==0.987976835296905
f(x) 0.342272159929166 x + 1.40719428011574
4.000 f(x)
R² ==0.991902653163242
0.334933038422027 x + 1.04572605785567
R² = 0.992653741339562
1/Vo

3.000 []= 40
2.000 []= 16
[]= 8
1.000
[]=0
0.000
0.000 2.000 4.000 6.000 8.000 10.000 12.000
1/[S]

c) El valor de Ki para el inhibidor.

' '
1 Km 1 ∝ ∝
= × + b=
Vo Vmáx [ S ] Vmáx Vmáx
[ I ] ' [I ]
∝' =b ×Vmáx ∝' =1+ ' Ki = '
Ki ∝ −1
[E] b α Ki
0 1,046 1,000 -
8 1,407 1,346 23,144
16 1,784 1,706 22,665
40 2,942 2,814 22,055
Promedio Ki 22,622

2. Enzima: Transaminasa Glutámico Pirúvica, inhibidor: Ácido 2 hidroxisuccínico

[2hidroxisuccínico] (µM) [2hidroxisuccínico] (µM)
0 1 2 5,1 0 1 2 5,1
[Sustrato] ( 1/[Sustrato
Velocidades iniciales (µmol min-1 mgProt.-1) 1/Velocidades iniciales (µmol min-1 mgProt.-1)
mM) ] (mM)
0,6 0,59 0,48 0,38 0,24 1,667 1,695 2,083 2,632 4,167
1,4 1,12 0,91 0,78 0,51 0,714 0,893 1,099 1,282 1,961
2,9 1,63 1,43 1,19 0,87 0,345 0,613 0,699 0,840 1,149
5,2 1,94 1,7 1,64 1,19 0,192 0,515 0,588 0,610 0,840
8 2,19 1,94 1,94 1,56 0,125 0,457 0,515 0,515 0,641
10,3 2,28 2,06 1,99 1,74 0,097 0,439 0,485 0,503 0,575
16 2,32 2,33 2,24 1,89 0,063 0,431 0,429 0,446 0,529
25,1 2,62 2,53 2,25 2,09 0,040 0,382 0,395 0,444 0,478

a) El valor de Km y Vmáx.
 1 Km 1 1 1 Km
= × + b= m=
Vo Vmáx [ S ] Vmáx Vmáx Vmáx

Cuando [I]=0
m= 0,795
b= 0,356
Vmáx = 2,809
µmol/min
Km= 2,232

b) El tipo de inhibición.

Es una inhibición competitiva lo cual quiere decir que tienen una misma Vmáx, pero
Km se ve afectado.

Tipo de inhibidor
4.500
4.000 f(x) = 2.26826677629854 x + 0.3732036921291
R² = 0.999708280833216 [I]=0
3.500
Linear ([I]=0)
3.000 [I]=1
2.500 f(x) = 1.35169460683859 x + 0.361210125800755 Linear ([I]=1)
1/Vo

2.000 R² = 0.99904243815481 [I]=2

f(x) = 1.02493762262444 x + 0.371467049363231 Linear ([I]=2)
1.500 R²
f(x)==0.999177189184087
0.794566218590811 x + 0.356033899493989 [I]=5,1
1.000 R² = 0.998401501566645
Linear ([I]=5,1)
0.500
0.000
0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400 1.600 1.800
1/[S[

c) El valor de Ki para el inhibidor.

1 Km α 1 1 Km α
= × + m=
Vo Vmáx [ S ] Vmáx Vmáx

[I ] [I]
α =m ×Vmáx α =1+ Ki=
Ki '
∝' −1

[I] m α Ki
0 0,795 1,000 -
1 1,025 1,290 3,449
2 1,352 1,701 2,852
5,1 2,268 2,855 2,750
Promedio Ki 3,017