ENZIMOLOGÍA

1. a) En la ecuación: P+L PL, escribir una expresión que esté

relacionada la función de Scatchar y la constante de disociación.

b) ¿Qué valor debería tener la concentración del ligando en relación con la constante de
disociación (en términos algebraicos) para saturar en un 50% a la proteína?

De acuerdo con la forma de esta ecuación, cuando la concentración de L es muy

pequeña (mucho menor que 1/K), la fracción de saturación es pequeña y
proporcional a la concentración de ligando libre, mientras que a valores altos de
L, la macromolécula se va saturando, y el valor de Y tiende a 1. 1/K es la
constante de disociación del complejo, y corresponde a la concentración de
complejo que da lugar a una saturación del 50%, Y = 0.5.

2. En un experimento de diálisis, la concentración de la proteína fue 10 -4M; en el cual se

determinaron las siguientes concentraciones, en el equilibrio:
[Ligando 0.209 0.623 1.333 2.500 4.667 10.88 20.91 100.98
total]x10-4M
[Ligando] total 0.200 0.600 1.000 2.000 4.000 10.00 20.00 100.00
en el líquido de
diálisis x10-4M

Determinar: los moles de ligando unidos por mol de proteína y la constante de afinidad.

3. Demuéstrese que la ecuación general MWC de cuatro sitios solamente produce

cooperatividad positiva y nunca cooperatividad negativa.

4.Pruébese que para n>1, la ecuación de Hill describe una actividad enzimática de unión
con cooperatividad positiva.

5.La velocidad de hidrólisis de un sustrato por una enzima alostérica se ha estudiado en

presencia de un activador a concentración saturante (experimento A), de un inhibidor a
concentración saturante (experiencia B) y en ausencia de un activador y de un inhibidor
(experiencia C). las velocidades de la reacción, expresadas en unidades arbitrarias son las
siguientes:

S (10-5)M A B C
1 0,62 0,1 0,375
2 1,1 0,18 0,65
3,5 1,67 0,27 1
5 2,1 0,33 1,25
7,5 2,6 0,41 1,55
10 2,95 0,47 1,75
20 3,7 0,59 2,2
35 4,2 0,67 2,5
50 4,4 0,7 2,6
 a. Parámetros cinéticos de A, B, C
b. ¿Qué modelo permite interpretar estos resultados?
c. ¿Cuál es la constante de Transformación?

6. La fijación del NAD+ sobre la deshidrogenasa del 3-P-gliceraldehído de levadura

origina un “quenching” de la fluorescencia de los triptófanos de la proteína (lo que
corresponde a una extinción de esta fluorescencia). Conociendo la extinción de
fluorescencia que acompaña a la fijación de un mol de NAD sobre el enzima, se
puede calcular para cada experiencia la concentración de NAD fijado. Este trabajo se
efectuó a pH 7.34, en presencia de enzima 10 -6M. Los triptófanos estaban excitados
a 300nm y la fluorescencia se midió a 350 nm.

[NAD] total (uM) [NAD] unido (uM)

20 3,7
15 3,5
10 3,3
8 3,05
6 2,7
5 2,5
4 2,15
3 1,8
2 1,3

Calcular el número de centros de fijación del NAD por mol de enzima y la constante de
asociación de cada uno de ellos.
CUESTIONARIO:

1. Para el estudio de reacciones con varios substratos; ¿qué nomenclatura y simbología es

útil para su estudio? ¿Qué ecuaciones cinéticas podemos obtener? Explique.

2. La nucleósido difosfoquinasa cataliza la fosforilación de un nucleósido difosfato por un

nucleósido trifosfato según el siguiente esquema:

XTP + YDP = XDP +YTP

Para determinar el mecanismo de esta reacción se han medido las velocidades iniciales de
fosforilación del citidíndifosfato (CDP) por el adenosíntrifosfato (ATP) a diferentes
concentraciones de substrato. Las velocidades que aparecen en la tabla se expresan en
nanomoles de producto aparecido por litro de medio reaccionante y por minuto.

[CDP] mM [ATP] mM

0.08 0.16 0.24

4 25.5 39 47

2 24.2 36 43

1.5 23.5 34.3 40.7

1 22 31.4 36.6

¿Mediante qué mecanismo procede la reacción? Determínense las constantes

correspondientes. Para verificar este mecanismo se ha ensayado el efecto inhibidor de los
productos de reacción.

a) La inhibición por el ADP se ha estudiado para diferentes concentraciones de CDP, en

presencia de ATP 0.25 mM. Las velocidades se expresan en las mismas unidades que
precedentemente:
[ADP] mM [CDP] mM

0.15 0.25 0.35 0.5 1

0 13.7 19.5 24 28.6 37

0.05 7.9 12 15 19.5 28.5

0.25 2.9 4.7 6.3 8.6 14.8

0.5 1.6 2.6 3.7 5 9.2

b) La Inhibición por el CTP se ha estudiado a diferentes concentraciones de ATP, en

presencia de CDP 2.5 mM. Las velocidades se expresan en las mismas unidades que
precedentemente:

[CTP] mM [ATP] mM

0.1 0.15 0.25 0.4

0 28.4 36 45.4 53.3

0.05 26.3 33.6 43 51.5

0.1 24.5 31.6 41 50

0.25 20 27 36 45

Determinense en ambos casos los tipos de inhibición y las correspondientes constantes de

inhibición. ¿Se hallan de acuerdo los resultados con el mecanismo deducido del estudio de
las velocidades iniciales de la reacción?
6. La fijación del NADPH+H + sobre la glutatión reductasa se ha seguido a 590nm. El NADPH+H+
no absorbe a esta longitud de onda y la variación de absorbacia observada corresponde a una
interacción entre la flavina de la glutatión reductasa y el NADPH+H +.
Se ha trabajado con una enzima 2,5µM y se ha medido la absorbacia en presencia de diferentes
concentraciones de NADPH+H +.

[NADPH+H+] Abs x 100

µM
0 0,2625
1,25 0,325
2,5 0,38
3,75 0,43
5 0,47
7,5 0,53
10 0,56
15 0,605
20 0,625
saturante 0,675

Determinar el número de centros de fijación del NADPH+H + por mol de enzima y la constante
de disociación de estos centros.

NADPH (uM) Absorbancia V PL

0 0,2625

1,25 0,325 0,236575629 0,59143907

2,5 0,38 0,416869383 1,04217346

3,75 0,43 0,557302844 1,39325711

5 0,45 0,709626778 1,77406695

7,5 0,53 0,885362768 2,21340692

10 0,56 1,101691481 2,7542287

15 0,605 1,489879863 3,72469966

20 0,625 1,897098965 4,74274741

Saturante (20) 0,675 1,690791232 4,22697808

 V V/L

0,23657563 0,1892605

0,41686938 0,16674775

0,55730284 0,14861409

0,70962678 0,14192536

0,88536277 0,11804837

1,10169148 0,11016915

1,48987986 0,09932532

1,89709896 0,09485495

1,69079123 0,08453956

0,2

0,15 y = -0,0571x + 0,1852

0,1

0,05

0
0 0,5 1 1,5 2

Si y=0; x=# centros de fijación

X= 3

m= K
K=0,0571uM

7. Un experimentador ha aislado un enzima que exhibe comportamiento cooperativo respecto al

sustrato. Por diálisis en equilibrio, se demuestra que el enzima fija, como máximo, dos moléculas
de un análogo de sustrato. Recomienza la experiencia en presencia de un inhibidor y encuentra
que el enzima fija todavía como máximo dos moléculas del análogo de sustrato. Dedujo las
conclusiones siguientes:
a) El enzima obedece al modelo K del MWC y b) La forma T puede fijar el análogo de sustrato.
¿Están justificadas estas conclusiones? Explique.

Si obedece al modelo K porque la K-catalitica de las formas R y T son iguales (KcR=KcT), lo

cual quiere decir que ambas formas pueden fijar el análogo del sustrato, y al haber la presencia
de un inhibidor, el equilibrio esta desplazado hacia la forma T, lo cual quiere decir que dicha
forma T de la enzima es la que fija el análogo de sustrato y la inhibición no es competitiva por
eso la enzima unida al inhibidor puede seguir con la misma afinidad porque conserva los centros
activos
8. Se ha estudiado una enzima alostérica que obedece al modelo K de MWC, la constante de
transformación de proteína 𝐿0 es 1 a 25°C y 0,01 a 15°C. la constante de disociación intrínseca
para el sustrato es de 10-5 M. La forma T no fija el sustrato, pero se asocia con un inhibidor (I),
cuya constante intrínseca es de 10-6 M a 25°C. La enzima es dimérica.

a) Calcular el valor de L para I= 10-5 M a 15°C y a 25°C.

15°C 25°C.
Lo=KR 0.01 1
Ki=KT 0.00001 0.000001
I 0.00001M 0.00001M
n=2; km=9,61 ∗ 10−7 𝑀

𝐼 𝐾𝑅 𝐼 𝐿𝐶𝑎(1+𝐶𝑎) 𝑛−1+𝑎(1+𝑎)𝑛−1
𝑎= ;𝐶 = ;𝑦= ;𝑦=
𝐾𝑅 𝐾𝑇 (𝐾𝑚+𝐼) 𝐿(1+𝐶𝑎)𝑛+(1+𝑎)𝑛

A 15°C

𝐼
𝑎= = 1 ∗ 10 −3
𝐾𝑅
𝐾𝑅
𝐶= = 1000
𝐾𝑇
𝐼
𝑦= = 0,9123
(𝐾𝑚 + 𝐼)

𝐿𝐶𝑎(1 + 𝐶𝑎) 𝑛−1 + 𝑎(1 + 𝑎) 𝑛−1 𝐿 ∗ 1000 ∗ 10−3 (1 + 1) 1 + 10−3 (1 + 10 −3 )1

𝑦= =
𝐿(1 + 𝐶𝑎) 𝑛 + (1 + 𝑎) 𝑛 𝐿(1 + 1) 2 + (1 + 10−3 ) 2

2𝐿 + 1,001 ∗ 10−3
0,9123 = ; 𝐿 = 0,5536𝑀
4𝐿 + 1,002001

A 25°C

𝐼
𝑎= = 1 ∗ 10 −5
𝐾𝑅
𝐾𝑅
𝐶= = 1000000
𝐾𝑇
𝐼
𝑦= = 0,9123
(𝐾𝑚 + 𝐼)

𝐿𝐶𝑎(1 + 𝐶𝑎) 𝑛−1 + 𝑎(1 + 𝑎) 𝑛−1 𝐿 ∗ 1000000 ∗ 10−5 (1 + 1000)1 + 10−3 (1 + 10−5 ) 1
𝑦= =
𝐿(1 + 𝐶𝑎) 𝑛 + (1 + 𝑎) 𝑛 𝐿(1 + 1000) 2 + (1 + 10−5 ) 2
 10010𝐿 + 1,00001 ∗ 10−3
0,9123 = ; 𝐿 = 1,00810−6 𝑀
1002001𝐿 + 1,00002

b) Cuál sería el aspecto de la curva de saturación de la enzima por el sustrato a 25°C y 15°C, en
ausencia de inhibidor y con inhibidor.

El aspecto de la curva se indica en la siguiente grafica

La diferencia entre las curvas a 25°C y 15°C es que la curva a 25°C es mucho más amplia que la
de 15°C

c) Se determinó la Vo de una reacción catalizada por un enzima con las siguientes concentraciones
de sustrato:

[S] Vo
mmol/L (mmol/L
min)

0,1 1,6 E -4

0,3 1,4 E -3

0,5 4 E -3

1 1,6 E -2

3 0,14

5 0,29

10 1,45

100 14,6

500 15,9

1000 16

Determinar el coeficiente de Hill y el Km aparente

 Log[Vo/(Vmax-
Log S Vo)]
-1 -4.999995657
-0.52287875 -4.057953945
-0.30103 -3.601951404
0 -2.999565488
0.477121255 -2.054175147
0.698970004 -1.733778187
1 -1.001494991
2 1.01822482
2.698970004 2.201397124

5
Log(Vo/Vmax-Vo)

y = 1,9654x - 3,0174
0 R² = 0,9993
-2 0 2 4
-5

-10
Log S

1 1 1 1
𝑏 = 𝐿𝑜𝑔 ( ) ; 10𝑏 = ; 𝐾𝑚𝑎𝑝 = 𝑏 ; 𝐾𝑚𝑎𝑝 = 3,0174
𝐾𝑚𝑎𝑝 𝐾𝑚𝑎𝑝 10 10

𝐾𝑚𝑎𝑝 = 9,61 ∗ 10−4 𝑚𝑚𝑜𝑙/𝐿

𝑚 = 𝑛ℎ

𝑛ℎ = 1,96 ~ 2

ENZIMOLOGÍA

1. Se ha estudiado a 40C la fijación del NAD sobre una deshidrogenasa, midiendo por
diálisis en equilibrio, el NAD libre y el NAD fijado (la concentración de enzima era 5 µM).
Las experiencias se efectuaron en ausencia y en presencia de sustrato; a 40 C la reacción
enzimática, que es muy lenta, puede considerarse prácticamente inexistente y
solamente intervienen los equilibrios de asociación:

[NAD] libre en µM [S] = 0 [NAD] fijado µM [S] = 5x10-4M

[S] saturante
0.5 0.04 1.43 0.36
1 0.085 2.5 0.76
2 0.21 4 1.62
3.5 0.462 5.4 2.9
5 0.78 6.25 4
7.5 1.4 7.14 5.36
10 2.1 7.7 6.3
20 4.7 8.7 8.1
 50 8.1 9.4 9.3

Suponiendo que se trate de un enzima alostérico, que fije exclusivamente el NAD y el

sustrato, calcúlese el número de centros de fijación del NAD y los parámetros de este
modelo (L0 , KNAD , KS).
Determínense, en ausencia de NAD, el porcentaje de forma T: en ausencia de S y cuando
S = 5x10-4M.

2. La fijación del 5´- AMP sobre la fosforilasa b, a 50 C, se ha seguido por el método de

velocidad de diálisis. Esta técnica, que se basa sobre la medida de la velocidad de diálisis
de un compuesto radiactivo a través de una membrana, permite determinar en todo
momento la concentración de compuesto libre.
Cuando se estudia la fijación del 5´- AMP sobre la fosforilasa b, se comprueba que la
variación de la velocidad de diálisis del 5´- AMP es un fenómeno complejo. El primer
fenómeno, rápido, extrapolado a tiempo cero, se halla relacionado con la fijación rápida
del ligando al enzima. El segundo fenómeno, lento, corresponde a una relajación del
sistema.
En la célula en la que se efectúa la medida se introducen 200 µl de fosforilasa b 2.5x10 -
5
M y 50 µl de disolución de AMP de concentración variable. Para cada e xperiencia se ha
determinado la concentración de ligando libre en el tiempo cero y a tiempo ∞, cuando
el sistema se halla enteramente relajado:

[AMP]total x10-5 M [AMP]libre x10-5 M [AMP]libre x10-5M

t=0 t=∞
10.5 7.5 7.2
7 4.5 4.05
4.5 2.5 2.15
2 0.95 0.8
1.1 0.49 0.43

a. ¿Cómo pueden explicarse los resultados para t = 0?

b. ¿Cómo pueden explicarse los resultados para t = ∞?
c. ¿A partir de qué serie de resultados se pueden determinar el número de centros de
fijación del 5´- AMP y la constante de disociación KD ?
d. ¿A qué forma de enzima corresponde?

3. Después de la purificación de una enzima alostérica que sigue el modelo K de MWC, el

equilibrio alostérico se halla desplazado, casi por completo, hacia la forma T. ¿Cuál será
el comportamiento del enzima respecto a la fijación del sustrato? ¿Cuál respecto a la
fijación de un inhibidor alostérico?
a) En la ecuación: P+L PL, escribir una expresión que esté
relacionada la función de Scatchar y la constante de disociación.

b) ¿Qué valor debería tener la concentración del ligando en relación con la constante de
disociación (en términos algebraicos) para saturar en un 50% a la proteína?

De acuerdo con la forma de esta ecuación, cuando la concentración de L es muy

pequeña (mucho menor que 1/K), la fracción de saturación es pequeña y
proporcional a la concentración de ligando libre, mientras que a valores altos de L,
la macromolécula se va saturando, y el valor de Y tiende a 1. 1/K es la constante
 de disociación del complejo, y corresponde a la concentración de complejo que da
lugar a una saturación del 50%, Y = 0.5.

2. En un experimento de diálisis, la concentración de la proteína fue 10 -4M; en el cual se

determinaron las siguientes concentraciones, en el equilibrio:

[Ligando 0.209 0.623 1.333 2.500 4.667 10.88 20.91 100.98

total]x10-4M

[Ligando] total 0.200 0.600 1.000 2.000 4.000 10.00 20.00 100.00
en el líquidode
diálisis x10 -4 M

Determinar: los moles de ligando unidos por mol de proteína y la constante de afinidad.

3. Demuéstrese que la ecuación general MWC de cuatro sitios solamente produce cooperatividad
positiva y nunc a c ooperatividad negativa.

4.P ruébese que para n>1, la ec uación de Hill describe una actividad enzimática de unión con
c ooperatividad positiva.

5.La velocidad de hidrólisis de un sustrato por una enzima alostérica se ha estudiado en presencia de
un activador a concentración saturante (experimento A), de un inhibidor a concentración saturante
(experiencia B) y en ausencia de un activador y de un inhibidor (experiencia C). las velocidades de la
reac c ión, expresadas en unidades arbitrarias son las siguientes:
S (10 - 5 )M A B C
1 0,62 0,1 0,375
2 1,1 0,18 0,65
3,5 1,67 0,27 1
5 2,1 0,33 1,25
7,5 2,6 0,41 1,55
10 2,95 0,47 1,75
20 3,7 0,59 2,2
35 4,2 0,67 2,5
50 4,4 0,7 2,6

a. P arámetros c inétic os de A, B, C
b. ¿Q ué modelo permite interpretar estos resultados?
c . ¿Cuál es la c onstante de Transformac ión?

6. La fijación del NAD + sobre la deshidrogenasa del 3 -P-gliceraldehído de levadura origina un

“quenching” de la fluorescencia de los triptófanos de la proteína (lo que c orresponde a una
extinción de esta fluorescencia). Conociendo la extinción de fluorescencia que acompaña a la
fijación de un mol de NAD sobre el enzima, se puede c alcular para c ada experienc ia la
c oncentración de NAD fijado. Este trabajo se efectuó a pH 7.34, en presencia de enzima 10 -6M.
Los triptófanos estaban exc itados a 3 0 0 nm y la fluoresc enc ia se midió a 3 5 0 nm.

[NAD] total (uM) [NAD] unido (uM)

 20 3,7
15 3,5
10 3,3
8 3,05
6 2,7
5 2,5
4 2,15
3 1,8
2 1,3

Calcular el número de centros de fijación del NAD por mol de enzima y la constante de asociación
de cada uno de ellos.

1. Demuéstrese que la ecuación general MWC de cuatro sitios solamente produce

cooperativi dad positiva y nunca cooperativi dad negativa.

Ecuación General de MWC

Unión de una molécula ligando a un estado R desplaza el equilibrio, de manera concertada,

hacia la formas R de > afinidad, La cooperatividad positiva se va aumentando cuando se
incrementa L Cooperatividad extrema es el representado por la situación KT = ∞ unión
ligando exclusiva en las formas R : conocido modelo MWR concertado
(Julio Pereto,2005)

2. Pruébese que para n>1, la ecuación de Hill describe una actividad enzimática de unión con
cooperativi dad positiva.

Para n = 2

[ S]0,9
Rs =
[ S]0,1
Rs = nh 81
Rs = 2 81
Rs = 9

Con un índice mayor a 1 siempre se obtendrá una raíz positiva

3. ¿Cuál es el proceso de activación para el quimiotripsinógeno?

El quimiotripsinógeno es un zimógeno (enzima inactiva), la cual mediante rupturas proteolíticas

se transforma en quimiotripsina(enzima activa).

El proceso de activación es el siguiente:

El mecanismo de activación puede resumirse en el siguiente esquema general:

E: proteasaactivante.

Z: zimógenos precursor (quimiotripsinógeno)

Ea: Enzima activada (quimio tripsina)

W: péptido liberado.

(Voet, 2006)
 4. ¿Qué diferencia a una cinética alostérica homotrópica de una heterotrópica?

En la cinéticahomotrópica son ejercidos por la unión de un ligando sobre la unión de otras

moléculas del mismo ligando a los sitio vacantes de la enzima.

 Sustrato sobre sustrato

 Activador sobre activador
 Inhibidor sobre inhibidor (Jeremy Mark Ver,2005)

En la cinética heterotropica son ejercidos por la unión de un ligando sobre la unión de moléculas
de otro ligamiento de la enzimas

 Sustrato sobre activador : sustrato sobre inhibidor

 Activador sobre sustrato a activador sobre inhibidor
 Inhibidor sobre sustrato , inhibidor s obre activados

(Jeremy Mark Ver,2005)

5. Comentar brevemente la utilidad de las enzimas en la terapia

La terapia enzimáticaactúa mejorado la función digestiva y asegura una buena digestiva y

asimilar de los nutrientes. La digestión insuficienteestablecen unas condiciones propensas a la
enfermedad por ejemplo los alimentos no digestivos apropiadamente favorecen
elintestinaldañina. Las proteínas se producen, los carbohidratos y ácidos grasos, se vuelven
tóxicos como las hitos aminas y el amoniaco, conocidos carcinógeno los enzimas digestivos
ingeridas .Por ejemplo las enzimas pancreáticas se han utilizado para detectar antígenos en la
superficie de las células cancerosas, permitiendo que el sistema inmunitario los identifique y los
destruya. Además las enzimas proteolíticas degradan la cubierta de células cancerosas
consiguiendo que la quimioterapia sea más efectiva en dosis menores.

(Mary K.,2008)

6. ¿Qué características comunes presentan la activación de un cimógeno pancreático en general

y la activación de la cascada de coagulación sanguínea?
- La activación se da por medio de un estimulo.
- El estimulo hace que actúe una proteasa activante sobre el zimógeno.
- La proteasa activante produce rupturas proteolíticas para que la enzima inactiva pase a una forma
activa.
7. Importancia Fisiológica en Cooperati vi dad Positiva
Pueden ser regulado por compuestos no análogos del sustrato (retro inhibición y retro activación.
permite amplificar cambios del sustrato como de los inhibidores o activadores, respondiendo con
cambios grandes en la velocidad de la reacción catalizado
Ejemplo la acción de la hemoglobina al momento de captar oxigeno para el torrente sanguíneo
(Mary K.,2008)

8. Importancia Fisiológica en Cooperati vi dad Negativa

Permite amortiguar cambios grandes en la concentración de ligando, respondiendo con cambios
pequeños es la velocidad de la reacción catalizada
Ejemplo relación entre el gliceraldehido 9-fosfato y la enzima gliceraldehido 3- fosfato
deshidrogenasas
. (Mary K.,2008)
9. Se determinó la velocidad inicial de una reacción catalizada por una enzima reguladora, con
la siguiente gama de [S o ]:

[S] mmol/L Vo (mmol/L min)

0,1 1,6x10-4

0,3 1,4x10-3

0,5 4x10-3

1,0 1,6x10-2

3,0 0,14

5,0 0,39

10,0 1,45

100,0 14,6

500,0 15,9

1000,0 16

1/[S] 1/Vo

10,0000 6250,0000

3,3333 714,2857

2,0000 250,0000

1,0000 62,5000

0,3333 7,1429

0,2000 2,5641

0,1000 0,6897

0,0100 0,0685
Determinar el coeficiente 0,0020 0,0629 de Hill y el Km aparente.

0,0010 0,0625

1 K0n,5 1
 n

vo V max* S V max

Dobles Recíprocos
7000,00
6000,00
5000,00
4000,00
1/V

3000,00
2000,00
1000,00
0,00
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00
1/[S]

1
 0,0625
v max
V max  16 mmol
L
 Log[S] Log[Vo/(Vmax-
Vo)]

-1,00 -5,00

-0,52 -4,06

-0,30 -3,60

0,00 -3,00

0,48 -2,05

0,70 -1,60

1,00 -1,00

2,00 1,02

2,70 2,20

Vo
Log  nLog[ S ]  n log K 0,5
V max  Vo

Linealización log-log
3,00
2,00 y = 1,967x - 3,0037
Log[Vo/(Vmax-Vo)]

1,00
0,00
-1,50 -1,00 -0,50 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00
-1,00
-2,00
-3,00
-4,00
-5,00
-6,00
Log[S]
 Y  1,967x  3,0037
m  nH
n H  1,967  2

 nH LogK0,5  3,0037
3, 0037

K 0,5  10 nH

3, 0037
K 0,5  10 2

mmol
K 0,5  31,7578
L

10. ¿Pueden existir inhibidores competitivos en el caso de un enzima alostérica que obedece al
modelo V de MWC? ¿Qué características deben presentar?

Si, debe presentar una acción sobre Vmax y mantener la constante de afinidad por el sustrato,
es decir, KR=KT.

11. La velocidad de hidrólisis de un sustrato por una enzima alostérica se ha estudiado en

presencia de un activador a concentración saturante (experimento A), de un inhibidor a
concentración saturante (experiencia B) y en ausencia de un activador y de un inhibidor
(experiencia C). las velocidades de la reacción, expresadas en unidades arbitrarias son las
siguientes:

S(10-5)M A B C

1 0,62 0,1 0,375

2 1,1 0,18 0,65

3,5 1,67 0,27 1

5 2,1 0,33 1,25

 7,5 2,6 0,41 1,55

10 2,95 0,47 1,75

20 3,7 0,59 2,2

35 4,2 0,67 2,5

50 4,4 0,7 2,6

a) Parámetros cinéticos de A,B,C

b) ¿Qué modelo permite interpretar estos resultados?
c) ¿Cuál es la constante de transformación?

1/S 1/A 1/B 1/C

100000,00 1,61 10,00 2,67

50000,00 0,91 5,56 1,54

28571,43 0,60 3,70 1,00

20000,00 0,48 3,03 0,80

13333,33 0,38 2,44 0,65

10000,00 0,34 2,13 0,57

5000,00 0,27 1,69 0,45

2857,14 0,24 1,49 0,40

2000,00 0,23 1,43 0,38

 Dobles Recíprocos [A]
1,80
1,60 y = 1E-05x + 0,1972
1,40
1,20
1,00
1/V

0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
0,00 20000,00 40000,00 60000,00 80000,00 100000,00 120000,00
1/[S]

Y  1x10 5 x  0,1972
1
X 0  Y 
V max
1
0,1972 
V max
M
V max  5,071
min

Km
m
V max
m * V max  Km
Km  5,071x10 5 M
 Dobles Recíprocos [B]
12,00

10,00 y = 9E-05x + 1,2513

8,00
1/V

6,00

4,00

2,00

0,00
0,00 20000,00 40000,00 60000,00 80000,00 100000,00 120000,00
1/[S]

Y  9 x10 5 x  1,2513
1
X 0  Y 
V max
1
01,2513 
V max
M
V max  7,9917
min

Km
m
V max
m * V max  Km
Km  7,1925x10 5 M
 Dobles Recíprocos [C]
3,00
y = 2E-05x + 0,3372
2,50

2,00
1/V

1,50

1,00

0,50

0,00
0,00 20000,00 40000,00 60000,00 80000,00 100000,00 120000,00
1/[S]

Y  2 x10 5 x  0,3372
1
X 0  Y 
V max
1
0,3372 
V max
M
V max  2,9656
min

Km
m
V max
m * V max  Km
Km  5,9312x10 5 M

5
4,5
4
3,5
3
2,5 Con activador
V

2 Con Inhibidor
1,5 Normal
1
0,5
0
0 0,0001 0,0002 0,0003 0,0004 0,0005 0,0006
S
Según el tipo de grafico obtenido al evaluar V vs, S, y además según los valores obtenidos en las
distintas linealización para cada experiencia, se puede deducir que el modelo que permite
interpretar estos resultados es un modelo Tipo V, donde la velocidad máxima varia en cada
experiencia pero el Km se mantiene constante.

En cuanto a la constante de transformación o L podemos decir que debido al modelo de tipo V,

tanto R como T presentan la misma afinidad por el sustrato, por lo que podemos decir que la
constante de equilibrio entre las dos formas.

𝑉𝑚𝑎𝑥 = 𝐾𝑅 𝑅 + 𝐾𝑇 𝑇

𝑅 = 157,59𝑥103 𝑀

𝑇 = 111,11𝑥103 𝑀

𝑇
𝐿=
𝑅

𝐿 = 0,71

12. Un enzima posee cuatro subunidades y se comporta de modo Michaeliano, respecto a su

substrato. ¿Puede tratase de un enzima alostérico que presente por otra parte, fenómenos
cooperativos? ¿Cuál será el aspecto de la curva de saturación de este enzima por un activador
alostérico? ¿y por un inhibidor alostérico? ¿Cuál será el aspecto de la curva de saturación por
el sustrato en presencia de un activador o de un inhibidor?

No puede tratarse de un enzima alostérica, ya que estas no muestran la cinética clásica

Michaeliana entre [S], Vmax y Km. Presenta una gráfica sigmoidea en vez de hiperbólica.
13. La fijación del NAD+ sobre la deshidrogenasa del 3-P-gliceraldehído de levadura origina un
“quenching” de la fluorescencia de los triptófanos de la proteína (lo que corresponde a una
extinción de esta fluorescencia). Conociendo la extinción de fluorescencia que acompaña a la
fijación de un mol de NAD sobre el enzima, se puede calcular para cada experiencia la
concentración de NAD fijado. Éste trabajo se efectuó a pH 7.34, en presencia de enzima 10 -6M.
Los triptófanos estaban excitados a 300nm y la fluorescencia se midió a 350 nm.

[NAD] total (uM) [NAD] unido (uM)

20 3,7

15 3,5

10 3,3
 8 3,05

6 2,7

5 2,5

4 2,15

3 1,8

2 1,3

Calcular el número de centros de fijación del NAD por mol de enzima y la constante de
asociación de cada uno de ellos.

NAD Fijado/ NAD Fijado

NAD Libre

0,226993865 3,7

0,304347826 3,5

0,492537313 3,3

0,616161616 3,05

0,818181818 2,7

1 2,5

1,162162162 2,15

1,5 1,8

1,857142857 1,3
 2
1,8
1,6
1,4 y = -0,6778x + 2,6939

Fijado/Libre
1,2
1
0,8
m=-k
0,6
0,4
0,2
0
1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
Fijado

𝑦 = −0,6778𝑥 + 2,6939
𝑑𝑜𝑛𝑑𝑒 𝑚 = −𝑘
−0,6778 = −𝑘
𝑘 = 0,6778 𝜇𝑀.

𝑐𝑢𝑎𝑛𝑑𝑜 𝑦 = 0 ; 𝑥 = #𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑜𝑠 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠 "𝑛"

0 = −0,6778𝑥 + 2,6939
2,6939
𝑥=
0,6778
𝑥 = 3,97 ; 𝑛 = 𝑥
𝑛 = 3,97 ≅ 4