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Actividad enzimática

Unidad internacional de actividad enzimática (U): cantidad de enzima que produce un micromol de producto en un minuto. Dados los valores normales de actividad de muchas enzimas, es mucho más común usar miliunidades (1 mU = 0,001 U).

Katal: cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por segundo.

1 katal = 6x10 7 U

Definiciones importantes en un proceso de purificación de enzimas.

Actividad

total

(U):

Cantidad

absoluta

preparación.

de

enzima

en

una

Actividad específica (U/mg): Actividad de la enzima por miligramo de proteína.

Recuperación (%): Fracción de la actividad total que se conserva tras cada paso de purificación.

Factor de purificación: Número de veces que hemos aumentado la actividad específica de nuestra enzima a lo largo de la purificación.

Tabla de purificación de una enzima

Paso de purificación

Proteína

A.T.

A.E.

R

F.P.

(mg)

(U)

(U/mg)

(%)

Extracto crudo

3.000

0,10

3,3x10 -5

100

1

Sulfato amónico 40%

300

0,07

2,3x10 -4

70

7

DEAE-celulosa

50

0,05

1,0x10 -3

50

30

Cromatoenfoque

10

0,04

4,0x10 -3

40

121

Recuperación (%): ATfinal /ATinic. X 100 Factor de purificación: AEfinal / AEinic.

Problema 1

Se ha purificado una enzima a partir de hígado de rata. En la purificación se partió de 500 ml de extracto crudo que contenía 2 g de proteína. 50 µ l de ese extracto crudo catalizaban, en condiciones óptimas de ensayo, la producción de 1 nmol de producto en 1 segundo. Tras varios pasos de purificación se obtuvieron 2 ml de una preparación de enzima pura que contenía 3 mg de proteína por mililitro y presentaba una actividad total de 120 U.

a) Calcular la concentración de la enzima en el extracto crudo en U/ml y katales/ml.

b) Determinar la actividad específica, en U/mg proteína, en el extracto crudo.

c) Calcular la recuperación del proceso de purificación y el número de veces que se ha purificado la enzima.

Problema 1

a) 1 nmol/seg = 0,001 µ moles/seg x 60 seg/min = 0,06 µ moles/min = 0,06 U en 50 µ l. 0,06 U/50 µ l x 1000 µ l/ml = 1,2 U/ml 1 katal = 1 mol P/seg = 10 6 µ moles/seg x 60 seg/min = 6x10 7 U => 1,2 U/6x10 7 U/katal = 2x10 -8 katales = 0,02 µ katales/ml

b) Actividad total E.C.= 1,2 U/ml x 500 ml = 600 U Proteína total E.C.= 2 g = 2.000 mg Actividad específica = 600 U/2.000 mg = 0,3 U/mg proteína

c) Recuperación = AT final/AT inicial (x100) = = 120 U / 600 U (x100) = 0,2 (x100) = 20% Purificación = AE final / AE inicial = = 20 U/mg / 0,3 U/mg = 66,7 veces

Proteína final = 3 mg/ml x 2 ml = 6 mg AT final = 120 U AE final = 120 U/6 mg = 20 U/mg

Problema 2

La descarboxilación enzimática de un ß-cetoácido, ensayada en 1 ml de mezcla de reacción, procede con las siguientes velocidades iniciales a las concentraciones de sustrato que se citan:

¡Cuidado!

S = ß-cetoácido

de sustrato que se citan: ¡Cuidado! S = ß-cetoácido 1 ml de mezcla de reacción [cetoácido]

1 ml de mezcla de reacción

[cetoácido] v o [S] v o 1/v o 1/[S] ( µ moles CO 2 /2min)
[cetoácido]
v o
[S]
v o
1/v o
1/[S]
( µ moles CO 2 /2min)
0,588
(M)
2,500 x 10 -3
1,000 x 10 -3
0,714 x 10 -3
0,526 x 10 -3
0,250 x 10 -3
( µ moles/min)
(mM)
(min/µ moles)
mM -1
0,294
2,5
3,4
0,4
0,500
0,250
1,0
4,0
1,0
0,417
4,8
1,4
0,208
0,714
5,4
1,9
0,370
0,185
0,526
7,9
4,0
0,252
0,126
0,250

A partir de estos datos calcular V máx y K M de esta reacción.

Problema 2

La K M y la V máx las obtenemos de la representación de dobles inversos de

Lineweaver-Burk. 8,0 " Regresión lineal y = ax + b r 2 = 0,996 =
Lineweaver-Burk.
8,0 "
Regresión lineal
y = ax + b
r 2 = 0,996
= 1,27 = pendiente = K M /V máx
a
1/v o
(min/µ mol )
= 2,885 = corte en Y
Corte en X = -(a/b)
b
6,0 "
Constantes:
4,0 "
1/V máx = 2,9
2,0 "
-1/K M = -2,3 mM -1 => K M = 0,44 mM
1/V máx = 2,9 min/µ mol =>
V máx = 0,346 µ moles min -1
-2
-1
0
1
2
3
4
5

-1/K M = -2,3

Cuestiones:

1/[S] (mM -1 )

a)

¿Cuántas unidades de enzima hay en la mezcla de reacción?

b)

¿Cuál es la concentración de la enzima en dicha mezcla?

c)

¿Podemos calcular la actividad específica de la enzima?

d)

¿Y la k cat (o número de recambio)?

Problema 11

Un extracto crudo enzimático contiene 20 mg de proteína/ml. 20 µ l de ese extracto crudo catalizan la producción de 3 µ moles de producto en 1 min, en condiciones óptimas de trabajo. Calcular:

a) La concentración de la enzima en el extracto crudo en U/ml.

b) La actividad específica de esta enzima en el extracto en U/mg de proteína.

c) La actividad total del extracto si tenemos 100 ml del mismo.

Los 20 µ l de extracto crudo contienen 3 U.

[Enzima] = 3U/20 µ l = 3U/0.02 ml = 150 U/ml

X

A.E. = [E] (U/ml) / [proteína] (mg/ml) = 150 U ml -1 / 20 mg ml -1 = 7,5 U/mg

X

A.T. = 150 U/ml x 100 ml = 15.000 U

Problema 12

Glutamina sintetasa de Anabaena cylindrica

M = 600 kDa

Extracto crudo

Preparación purificada

Proteína

4.200 mg

4 mg

A.T.

186 U

37,5 U

Calcular:

Recuperación del proceso de purificación

Número de veces que se ha purificado la enzima

Número de recambio

Recuperación =

A.T. (pura)

A.T. (E.C.)

x 100 =

37,5

186

x 100 = 20%

Factor de purificación =

A.E. (pura)

A.E. (E.C.)

Nº de recambio =

A.T. (pura)

nº moles E

=

37,5 U / 4 mg

=

186 U / 4200 mg

= 211,7

37,5 µ moles S min -1

= 5625 min -1

6,67 x 10 -3 µ moles de E

1 mol E pesa 600.000 g => 1 µ mol pesa 600 mg => 4 mg E = 6,67 x 10 -3 µ moles de E

Problema 7

Dos inhibidores diferentes.

[S]

v

(mM) ( µ mol l -1 min -1 )

va

( µ mol l -1 min -1 )

[I] = 1,5 mM vb

( µ mol l -1 min -1 )

0,2

1,67

0,625

0,83

0,4

2,86

1,176

1,43

0,8

4,44

2,11

2,22

1,6

6,15

3,48

3,08

3,2

7,62

5,16

3,81

Decir qué tipo de inhibidor es cada uno y determinar todos los parámetros cinéticos.

Problema 7

La K M y la Vmáx las obtenemos de la representación de dobles inversos.

a: competitivo " b: no competitivo "

[I a ] = 1,5 mM Vmáx = 10 µ moles min -1 l -1 KM = 3 mM

[I b ] = 1,5 mM Vmáx = 5 µ moles min -1 l -1 KM = 1 mM

[I] = 0 V máx = 10 µ moles min -1 l -1 K M = 1 mM

a" 1,0 1/v b" 0,2 ! 0,5 0,1 ! -0,33 !
a"
1,0
1/v
b"
0,2 !
0,5
0,1 !
-0,33 !

-1

0

1

2

3

4

5

( µ mol -1 l min)

1/[S] (mM -1 )

Cálculo de Ki:

Ki a

KM = K M (1 + [I]/Ki a ); 3 mM = 1 mM (1 + 1,5 mM/Ki a );

Ki a = 0,75 mM

Ki b

Vmáx = V máx / (1 + [I]/Ki b )

5 µ moles min -1 l -1 = 10 µ moles min -1 l -1 /(1 + 1,5 mM/Ki b )

=> Ki b = 1,5 mM

K M = 75 µ M.

a) Calcular V máx

Problema 6

Grado de inhibición

Cuando [S] 0 = 50 mM consume el 30% en 15 min.

[S] 0 50 mM >>> K M (0,075 mM) => v = V máx

30%

K M (0,075 mM) => v = V m á x 30% V m á x

V máx =

0,3 x 50 mM

15 mM

 

=

 

= 1 mM min -1

 

15 min

15 min

En presencia de un inhibidor ([I] = 50 µ M) la representación tiene

. b) ¿Qué tipo de inhibición se ha producido? Calcular K i

El comportamiento corresponde a un inhibidor incompetitivo.

El comportamiento corresponde a un inhibidor incompetitivo. pero la ordenada en el origen es V ’

pero la ordenada en el origen es

un inhibidor incompetitivo. pero la ordenada en el origen es V ’ m á x =

Vmáx =

V máx

(1+[I]/K i )

=

V máx

2

1+[I]/K i

= 2 => [I]/K i = 1 => [I] = K i = 50 µ M

á x = V máx (1+[I]/K i ) = V máx 2 1+[I]/K i = 2

Problema 6

c) Calcular el grado de inhibición (i) cuando el ensayo se hace a [S] = 150 µ M, en presencia de 100 µ M del inhibidor anterior.

Grado de inhibición: i = 1 -

v i

v

v =

V máx

[S] 1 mM min -1 x 150 µ M

=

K M + [S]

75 µ M + 150 µ M

= 0,667 mM min -1

v i =

[S] V máx
[S]
V máx

=

K M + [S] (1+[I]/K i )

1 mM min -1 x 150 µ M

M + [S] (1+[I]/K i ) 1 mM min - 1 x 150 µ M 75

75 µ M + 150 µ M (1+100 µ M/50 µ M)

i

= 1

-

0,285 mM min -1

0,667 mM min -1

= 0,57 = 57%

= 0,285 mM min -1

Problema 10

Muermasa Representación dobles inversos:

X= 0 => Y = 0,8 ( µ M/min) -1 Y= 0 => X = -0,02 ( µ M) -1

Se ensayan dos inhibidores: muermirulina y ß-muermol En ambos casos el corte en Y= 1,6 ( µ M/min) -1

La pendiente:

m ßm = 40 min

m mr = 80 min

a) ¿Cuáles son la K M y V máx de la reacción sin inhibidor?

K M = -(1/-0,02) ( µ M) -1 = 50 µ M

V máx = 1/0,8 ( µ M/min) -1 = 1,25 µ M/min

Problema 10

b) ¿Qué tipo de inhibidores son el ß-muermol y la muermirulina?

ß-muermol:

m = 40 min = K M /V máx => KM = 40 min x 0,625 µ M min -1 = 25 µ M Es un inhibidor incompetitivo

muermirulina:

m = 80 min = K M /V máx => KM = 80 min x 0,625 µ M min -1 = 50 µ M = K M Es un inhibidor no competitivo

Vmáx = 1/1,6 ( µ M/min) -1 = 0,625 µ M min -1

Vmáx = 0,625 µ M min -1

c) Si [I] = 5 mM, determinar K i para ambos inhibidores.

V

máx

V máx = (1+[I]/K i )

Vmáx = 1/2 V máx => (1+[I]/K i ) = 2 => [I] = K i = 5 mM

Problema 10

d) Calcular el grado de inhibición a [S] = 0,1 mM para el ß-muermol. [I] = 5 mM

Calculamos con la ecuación de Michaelis-Menten la v o y la v' o en estas condiciones:

v o = 0,83 µ M min -1

v' o =

0,5 µ M min -1

i = 1-(v' o / v o )= 1-(0,5/0,83) = 1-0,6 = 0,4 (40%)

Cuestiones

Indicar qué ocurre con la constante de Michaelis-Menten y la velocidad máxima en el ensayo de una enzima en las siguientes condiciones:

a) Se duplica la concentración de enzima.

La K M no se altera. La K M es una constante de la enzima (a una temperatura dada) para un sustrato específico y no depende de ningún otro factor.

Al duplicar la cantidad de enzima, duplicaremos la velocidad máxima en el ensayo. V máx = k 2 [Et]

b) Se añade un inhibidor no competitivo a una concentración igual a dos veces la Ki.

La K M no se altera en presencia de un inhibidor no competitivo. La V máx disminuiría hasta 1/3 de su valor en ausencia del inhibidor.

máx =

V máx

=

1 + ([I]/K i )

V máx

1 + (2K i /K i )

= 1/3 V máx

c) Se añade un inhibidor acompetitivo a una concentración equivalente a la Ki.

Tanto K M como V máx disminuyen de la misma forma en presencia de un inhibidor acompetitivo. La disminución de ambos parámetros los llevaría a 1/2 de su valor en ausencia del inhibidor.

1 + ([I]/K i )

= 1 + (K i /K i ) = 2

K' M = K M / (1 + ([I]/K i )) = K M /2

máx = V máx / (1 + ([I]/K i )) = V máx /2

Problema fuera de serie

Se está caracterizando una enzima recién purificada. Para determinar su peso molecular se ha hecho una electroforesis en SDS, siendo la movilidad relativa de la única banda igual a 0,51. Las movilidades relativas del patrón de pesos moleculares se resumen en la siguiente tabla:

Masa molecular (kDa)

63

43

20

12

Rf

0,29

0,45

0,72

0,9

La concentración de la enzima en el extracto crudo es de 4,2 mg ml -1 . Se toman 50 µ l de dicho extracto y se ensayan en 1,5 ml de mezcla de reacción, resultando la siguiente tabla:

[Sustrato] ( µ M)

2

4

8

16

v o ( µ moles min -1 ml -1 )

6,26

10,00

13,33

16,66

Calcular la K M y la k cat (número de recambio) de la enzima.

Problema fuera de serie

La K M la obtenemos de la representación de dobles inversos:

0,16 0,08 0,045
0,16
0,08
0,045

-0,20

Corte en Y= 1/V máx = 0,045 => V máx = 22 µ moles min -1 ml -1

Corte en X= -1/K M = -0,20 => K M = 5,0 µ M

1/v

( µ moles -1 min ml)

-0,2

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

1/[S] ( µ M -1 )

Problema fuera de serie

El PM de la enzima, necesario para calcular el número de recambio, lo obtenemos de la representación de los logaritmos de pesos moleculares frente a la movilidad.

log PM

2,0

1,5

1,0

0,5

Log PM = 1,54 => PM = 35.000 Rf de la proteína problema 0 0,25
Log PM = 1,54 => PM = 35.000
Rf de la
proteína
problema
0
0,25
0,5
0,75
1,0

Rf

Problema fuera de serie

Para calcular la k cat (N.R.), tenemos que conocer la actividad específica:

Número de unidades en el ensayo = 22 µ moles min -1 ml -1 x 1,5 ml = 33 U

33 U / 0,05 ml = 660 U/ml

A.E. = 660 U ml -1 / 4,2 mg ml -1 = 157 U / mg de proteína

¡¡50 µ l es el volumen ensayado!!

1 mol de enzima pesa 35.000 g => 1 µ mol pesa 35 mg => => 1 mg = 0,0286 µ moles de enzima

157 µ moles S min -1

N.R. =

0,0286 µ moles E

= 5490 min -1

Tiempo de un ciclo catalítico = 1 / N.R. = 1,82 x 10 -4 min = 10,9 ms

Problema de examen

Se ensayan 30 µ l de una preparación de enzima pura en un volumen de ensayo de 2 ml que contiene 0,1 M de sustrato, obteniéndose una velocidad de 0,2 µ moles min -1 ml -1 . ¿Qué cantidad de enzima hay en el ensayo? Calcula la actividad total de la preparación enzimática si su volumen es de 10 ml. K M = 0,1 mM .

La velocidad del enunciado es Vmáx, ya que [S] > 100 K M . Vmáx = 0,2 µ moles min -1 ml -1 , es decir 0,2 U ml -1 Volumen de ensayo = 2 ml La cantidad total de enzima en el ensayo será de 0,2 U ml -1 x 2 ml = 0,4 U

Si 30 µ l de preparación pura contienen 0,4 U de enzima y el volumen total de preparación es de 10 ml:

A.T. = 0,4 U/0,03 ml x 10 ml = 133,3 U

Problema de examen

Cuando se ensaya la actividad de una enzima con distintas [S], en presencia de un cierto inhibidor a una concentración de 100 µ M, y se representan gráficamente los resultados mediante la representación de dobles inversos, la pendiente de la recta obtenida es 3 veces mayor que cuando el experimento se hace en ausencia del inhibidor, pero la intersección en el eje de abcisas es la misma. ¿Qué tipo de inhibición se ha producido? Calcula la Ki del inhibidor.

Sabemos que K M no varía, puesto que el corte en abcisas es el mismo. Para que aumente la pendiente, que es K M /Vmáx, tiene que disminuir Vmáx, así que se trata de inhibición no competitiva. Si la pendiente aumenta 3 veces quiere decir que Vmáx ha disminuido 3 veces. Como Vmáx = Vmáx / (1+[I]/Ki), eso implica que 1+[I]/Ki = 3. De aquí podemos despejar el valor de Ki = 50 µ M.

Problema 14

Una enzima tiene un peso molecular de 60.000 y 6 sitios activos por molécula. La actividad enzimática de una preparación pura es de 12 µ moles de sustrato transformado cada 2 min en presencia de 18 µ g de enzima. Calcula la actividad molar por centro catalítico de la enzima.

N.R. =

µ moles S / min

µ moles E

=

6 µ moles S / min

= 2 x 10 4 min -1

0,018 mg E/ 60 mg µ mol -1

A.c.c. = N.R. / nº sitios = 2 x 10 4 min -1 / 6 = 3.333 min -1

Problema 27

Cuando se ensaya la actividad de una enzima con distintas [S], en presencia de un cierto inhibidor a una concentración de 100 µ M, y se representan gráficamente los resultados mediante la representación de dobles inversos, la pendiente de la recta obtenida es 4 veces menor que cuando el experimento se hace en ausencia del inhibidor, pero la intersección en el eje de ordenadas es la misma. ¿Corresponde este comportamiento a algún tipo de inhibidor? Calcula, si procede, la Ki del inhibidor.

Sabemos que Vmáx no varía, puesto que el corte en ordenadas es el mismo. Para que disminuya la pendiente, que es K M /Vmáx, tiene que disminuir K M . No hay ningún tipo de inhibidor reversible que disminuya K M dejando inalterada Vmáx.

Problema 28

Se han determinado algunos parámetros cinéticos de dos enzimas, A y B. Así, sus valores de K M resultan ser de 100 µ M para A y 20 mM para B, mientras que los valores de k cat son de 20.000 min -1 y 60.000 min -1 , respectivamente. ¿Cuál de las dos enzimas presenta mayor eficiencia catalítica? Justifica brevemente tu respuesta.

El parámetro que mejor define la eficiencia catalítica es el conciente k cat /K M . Cuanto mayor es este valor más eficiente es la enzima. En nuestro caso:

k cat /K M de la enzima A = 20.000 min -1 / 10 -4 M = 2 x 10 8 M -1 min -1

k cat /K M de la enzima B = 60.000 min -1 / 0,02 M = 3 x 10 6 M -1 min -1

Luego la enzima A es bastante más eficiente que la B.

Problema 29

Completa esta tabla de purificación:

Paso de purificación

Proteína

A.T.

A.E.

Recuper.

Factor de purif.

(mg)

(U)

(U/mg)

(%)

Extracto crudo SA 45% CM-celulosa Cromatoenfoque

1000

0,030

3,0 x 10 -5 2,4 x 10 -4 1,0 x 10 -3 3,8 x 10 -3

100

1

100

0,024

80

8

17

0,017

56,7

33,3

3,4

0,013

43,3

126,7

Problema de examen

Cuando se ensaya la actividad de una enzima con distintas [S], en presencia de un cierto inhibidor a una concentración de 100 µ M, y se representan gráficamente los resultados mediante la representación de dobles inversos, la pendiente de la recta obtenida es 3 veces mayor que cuando el experimento se hace en ausencia del inhibidor, pero la intersección en el eje de ordenadas es la misma. ¿Qué tipo de inhibición se ha producido? Calcula la Ki del inhibidor.

Sabemos que Vmáx no varía, puesto que el corte en ordenadas es el mismo. Para que aumente la pendiente, que es K M /Vmáx, tiene que aumentar K M , así que se trata de inhibición competitiva. Si la pendiente aumenta 3 veces quiere decir que K M ha aumentado 3 veces. Como KM = K M x (1+[I]/Ki), eso implica que 1+[I]/Ki = 3. De aquí podemos despejar el valor de Ki = 50 µ M.

Problema de examen

Para purificar una enzima se partió de un extracto crudo que contenía 8.400 mg de proteína con una actividad total de 372 U. Al final del proceso se obtuvo una preparación de la enzima pura, que contenía 8 mg de proteína con una actividad total de 75 U. Calcula la recuperación en el proceso de purificación y el número de veces que se ha purificado la enzima. ¿Cuál es el número de recambio de esta enzima sabiendo que su masa molecular es de 600 kDa?

Recuperación = AT final /AT inicial x 100 = 75 U/372 U x 100 = 20,8 %

Factor de Purificación = AE final /AE inicial = (75 U / 8 mg) / (372 U / 8400 mg) = 213 veces

N.R. = AT final / µ moles E = (75 µ moles S / min) / (0,0133 µ moles E) = 5639 min -1

Problema de examen

Una enzima presenta una K M de 50 µ M y una Vmáx de 1,25 µ M/ min. Al estudiar el efecto de un inhibidor, a concentración 5 mM, la representación de los datos por el método de dobles inversos daba como resultado una recta con una pendiente de 80 min y que cortaba al eje Y en 1,6 min/µ M. ¿De qué tipo de inhibidor se trata? Calcula la Ki y el grado de inhibición para [S] = 0,1 mM.

Problema de examen

Sabemos que Vmáx es 0,625 µ M/min (el inverso del corte en Y), es decir, la mitad de Vmáx. Como la pendiente, que es K M /Vmáx, tiene un valor de 80, podemos deducir que el valor de K M en presencia del inhibidor es de 50 µ M. Puesto que K M no se altera y Vmáx disminuye, podemos afirmar que se trata de una inhibición no competitiva. Si Vmáx ha disminuido a la mitad, y puesto que Vmáx = Vmáx/(1+[I]/Ki), eso implica que 1+[I]/Ki = 2. De aquí podemos despejar el valor de Ki = 5 mM.

Para determinar el grado de inhibición calculamos, mediante la ecuación de M-M, v 0 y v0 en las condiciones establecidas:

Grado de inhibición = 1- v0 / v 0 = 1 – 0,42/0,83 = 0,5 (50 %).

Problema de examen

Define la unidad internacional de actividad enzimática (U). ¿Qué cantidad de enzima habría en un ensayo de 1 ml de volumen del que se obtienen los siguientes parámetros cinéticos: K M = 20 mM, pendiente de la representación de dobles inversos = 40 min, k cat = 6.000 min -1 .

Es la cantidad de enzima que produce un micromol de producto en un minuto en condiciones óptimas de ensayo.

El parámetro que nos permite determinar la cantidad de enzima es la Vmáx, en la que el S es saturante. Este dato lo podemos obtener puesto que conocemos K M y pendiente = K M /Vmáx. En este ensayo Vmáx = 0,5 mM/min, y como el volumen de ensayo es 1 ml, habría una cantidad de E capaz de transformar 0,5 µ moles S min -1 en condiciones óptimas, es decir, 0,5 U.

Problema de examen

Cuando se ensaya la actividad de una enzima con distintas [S], en presencia de un cierto inhibidor a una concentración de 60 µ M, y se representan gráficamente los resultados mediante la representación de dobles inversos, la pendiente de la recta obtenida es la misma que cuando el experimento se hace en ausencia del inhibidor, pero la ordenada en el origen aumenta cuatro veces. ¿Qué tipo de inhibición se ha producido? Calcula la Ki del inhibidor.

Las rectas paralelas nos permiten deducir que varían tanto K M como Vmáx, y además en el mismo factor, cosa que solo ocurre en la inhibición incompetitiva. Si la ordenada en el origen aumenta 4 veces quiere decir que Vmáx ha disminuido 4 veces. Como V’máx = Vmáx/(1+[I]/Ki), eso implica que 1+[I]/Ki = 4. De aquí podemos despejar el valor de Ki = 20 µ M.