CINETICA ENZIMATICA

JOHAN SEBASTIAN ARISMENDI PEÑA

6142397

LUZ B. PARDO R.
Profesora

FUNDACION UNIVERSIDAD DE AMERICA

FACULTAD DE INGENIERIAS
BIOQUIMICA
GRUPO 2
BOGOTÁ D.C
2017
CINETICA ENZIMATICA

La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios
proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la
especificidad de la enzima. La velocidad de una reacción catalizada por una enzima puede medirse
con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar la enzima. La
medida se realiza siempre en condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, y se
utiliza concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción
observada es la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse midiendo la aparición
de los productos con respecto a la desaparición de los reactivos mediante curvas de progreso.

Al medir la velocidad de aparición de producto en función del tiempo se obtienen la llamada curva
de avance de reacción, o simplemente, la cinética de la reacción. A medida de que la reacción
transcurre, la velocidad de acumulación del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el
sustrato de la reacción. Para evitar esta complicación se procede a medir la velocidad inicial de la
reacción (Vo). La velocidad inicial de la reacción es igual a la pendiente de la curva de avance a
tiempo cero. De esta forma, la medida de Vo se realiza antes de que se consuma el 10% del total del
sustrato de esta forma se puede considerar [S] como esencialmente constante a lo largo del
procesos.

Para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto de la concentración inicial de sustrato sobre la
velocidad inicial de la reacción, manteniendo la cantidad de enzima constante. Si representamos Vo
frente a [S]o obtenemos una gráfica como la de la Figura de la derecha. Cuando [S]o es pequeña, la
velocidad inicial es directamente proporcional a la concentración de sustrato, y por tanto, la
reacción es de primer orden. A altas [S]o, el enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la
velocidad ya no depende de [S]0. En este punto, la reacción es de orden cero y la velocidad es
máxima (Vmax).
La velocidad de una reacción catalizada por un enzima depende de:

 La concentración de moléculas de sustrato [S]

 La temperatura
 La presencia de inhibidores
 pH del medio, que afecta a la conformación (estructura espacial) de la molécula
enzimática
La unidad de actividad enzimática (U) como la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1
µmol de sustrato en un minuto. La actividad específica es el número de unidades de enzima por
miligramo de proteína (U/mg prot) o por mililitro de disolución (U/ml). Recientemente, el Sistema
Internacional de unidades (SI) ha definido la unidad de actividad enzimática como la cantidad de
enzima que transforma 1 mol de sustrato por segundo. Esta unidad se llama katal (kat). Como 1 mol
son 106 µmoles y 1 minuto son 60 segundos, resulta que 1 katal equivale a 60 x 106 U. Esta unidad
es muy grande, de forma que se utilizan frecuentemente los submúltiplos como el microkatal (µkat,
10-6 kat) o el nanokatal (nkat, 10-9 kat).
Cuando se conoce el peso molecular del enzima puro y el número de centros activos por molécula
de enzima, las medidas de actividad enzimática permiten calcular el número de recambio del
enzima, o sea, el número de reacciones elementales que realiza el enzima por cada centro activo y
por unidad de tiempo.
CURVA DE PROGRESO
La rapidez de la reacción se obtiene a partir de la pendiente de las tangentes a la curva, es decir el
cambio de concentración de producto y sustrato con respecto al tiempo.

CURVA DE PROGRESO
Tiempo (s) sustrato (µmol) producto (µmol) TANGENTE
0 100 0 0
5 90 10 10,931
10 81 19 21,862
15 72,9 27,1 32,793
20 65,6 34,4 43,724
25 59 41 54,655
30 53,1 46,9 65,586
35 47,8 52,2 76,517
40 43 57 87,448
45 38,7 61,3 98,379
60 34,9 65,1 131,172

CURVA DE PROGRESO
100
f(x) = 2.19
0 x⁴ x− +0 0x³ + 0.03 x² − 2.19 x + 100.08
90 R² = 1
80
70
60 f(x) = − 0 x⁴ + 0 x³ − 0.03 x² + 2.19 x − 0.08
R² = 1
[S] [P]

50
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

tiempo (s)

Y=-5E-6X4+0,0005X3-0,0318X2+2,1863X-
0,0785
Y´=-0,00002X3+0,0015X2-0,0636X+2,1863
Vo 2,1862
=
DETERMINACION DE PARAMETROS CINETICOS MEDIANTE DIFERENTES
MODELOS

A Vo 1/A 1/Vo A/Vo Vo/A -A

0 0 0 0 0 0 0
10 28,6 0,1 0,034965035 0,34965035 2,86 -10
20 44,4 0,05 0,022522523 0,45045045 2,22 -20
30 54,5 0,033333333 0,018348624 0,55045872 1,81666667 -30
40 61,5 0,025 0,016260163 0,6504065 1,5375 -40
50 66,7 0,02 0,014992504 0,74962519 1,334 -50
60 70,6 0,016666667 0,014164306 0,84985836 1,17666667 -60
70 73,7 0,014285714 0,013568521 0,94979647 1,05285714 -70
80 76,2 0,0125 0,01312336 1,04986877 0,9525 -80
90 78,3 0,011111111 0,012771392 1,14942529 0,87 -90
100 80 0,01 0,0125 1,25 0,8 -100

1. Modelo Michaelis-Mentel
Este modelo adopta la hipótesis de estado estacionario, según el cual la concentración del
complejo enzima-sustrato es pequeña y constante a lo largo de la reacción, por lo tanto la
velocidad de formación del complejo es igual a la de su disociación.

SISTEMA MICHAELIS-MENTEL
90

80

70

60

50
Vo

40

30

20

10

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
[A]

SISTEMA MICHAELIS-
MENTEL

A Vo
0 0
 10 28,6
20 44,4
30 54,5
40 61,5
50 66,7
60 70,6
70 73,7
80 76,2
90 78,3
100 80

Vmax=80
V 1 =40
2
Km=18
2. Modelo Lineweaver-Burk
Se emplea como herramienta grafica para calcular los parámetros cinéticos de una enzima,
se emplea una linealizacion para determinar los diferentes parámetros.

SISTEMA LINEWEAVER-BUCK
SISTEMA LINEWEAVER-
0.04
BUCK
1/A 1/Vo
f(x) = 0.25 x + 0.01
0.04

0R² = 1 0.030
0,1 0,034965035 0.03
0,05 0,022522523
0.02
1/Vo

0,033333333 0,018348624
0.02
0,025 0,016260163
0,02 0,014992504 0.01

0,016666667 0,014164306 0.01

0,014285714 0,013568521 0
-0.05
0,0125 -0.030,01312336 -0.01 0.01 0.03 0.05 0.07 0.09 0.11
1/[A]
0,011111111 0,012771392
0,01 0,0125

KM
∗1
1 V Max 1
= +
V0 [ A] V Max

Al momento de hacer la linealizacion se emplean los términos de la ecuación de la

recta y=mx + b para obtener los diferentes parámetros Vmax y Km

Donde
 km
m=
Vmax

km
0.2498=
Vmax

1
b=
Vmax

1 1
0.01= =Vmax= =100
vmax 0.01

Km=0.2498∗100=24.98

3. Modelo de Hanes
En este modelo las constantes se determinan teniendo en cuenta la ecuación de la
recta.

SISTEMA HANES SISTEMA HANES

A A/Vo
1.4
0 0
1.2 f(x) = 0.01 x + 0.25
10 0,34965035
1 R² = 1
20 0,45045045
30 0.8 0,550458716
[A]/Vo

40 0.6 0,650406504
50 0.4 0,749625187
60 0.2 0,849858357
70 0 0,949796472
80 0 20
1,049868766 40 60 80 100 120

90 1,149425287 [A]
100 1,25
 [A] 1 K
= A+ M
V o V Max V Max

Al momento de hacer la linealizacion se emplean los términos de la ecuación de la

recta y=mx + b para obtener los diferentes parámetros Vmax y Km

Donde

1
m=
V Max

1
0,01=
V Max

1
Vmax= =10 0
0.01

Km
b=
Vmax

Km=100∗0.2502=25.02

4. Modelo de Hofstee
En este modelo las constantes se determinan teniendo en cuenta la ecuación de la
recta.
 SISTEMA HOFSTEE
Vo/A Vo SISTEMA HOFSTEE
0 90 0
2,86 80 f(x) =28,6
− 25.01 x + 100.01
R² = 1
2,22 70 44,4
60
1,8166666 54,5
7 50
Vo

1,5375 40 61,5
30
1,334 66,7
20 Vo
1,1766666
10
70,6 V o =−K M +V Max
7 [A]
0
1,0528571
0.5 73,7 1 1.5 2 2.5 3
4 Vo/[A]
0,9525 76,2
0,87 78,3
0,8 80

Al momento de hacer la linealizacion se emplean los términos de la ecuación de la

recta y=mx + b para obtener los diferentes parámetros Vmax y -Km

Donde

b=Vmax

100.01=Vmax

m=−Km

25 .007= Km

5. Modelo Eisenthal y Cornish-Bowden

 En este
SISTEMA EISENTHAL Y CORNISH-BOWDEN modelo se
90 estima Km y
Vmax
80
mediante la
70 mediana de
60 los
50 estimativos.
Vo

40
SISTEMA EISENTHAL Y
30 CORNISH-BOWDEN
20 -A Vo
10 0 0
0 -10 28,6
10 00 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 00
-1 -1 - - - - - - - - - 1 -20 44,4
[A] -30 54,5
-40 61,5
-50 66,7
-60 70,6
6. Los resultados obtenidos mediante los diferentes modelos son
-70 73,7
-80 76,2
Modelo Km Vmax -90 78,3
Michaelis-Mentel 18 80 -100 80
Lineweaver-Burk 24.98 100 Vm 100
Hanes 25.02 100 Ka 26
Hofstee 25.007 100.01
Eisenthal y
26 100
Cornish-Bowden

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