Validacion de Métodos Analiticos - Parte 2

INSTITUTO NACIONAL DE CALIDAD
VALIDACION DE MÉTODOS
ANALITICOS- PARTE 2
Rocio Taquire
Especialista del Laboratorio de Química
Zambrano Orgánica
EXPOSITOR
1
CONTENIDO
01 P R EC I S I O N
INACAL PERÚ
02 V E R AC I DA D
03 E X AC T I T U D
04 RO B U ST E Z
05 R ES U LTA D O S D E VA L I DAC I Ó N
4
RESUMEN DE UN PROCESO DE VALIDACIÓN
Intervalo de
Limite
INACAL PERÚ
Selectividad trabajo
Cuantificación
(linealidad)
INFORME
PLAN DE Limite de
Precisión Sensibilidad
Detección DE
VALIDACION
VALIDACION
Veracidad Exactitud Robustez

INACAL PERÚ
PRECISION
01
6
PRECISION
DEFINICIÓN - VIM 2.15
grado de concordancia entre las indicaciones o los

INACAL PERÚ
valores medidos obtenidos en mediciones repetidas

sobre un mismo objeto u objetos similares, bajo
condiciones especificadas.
Valor
Réplica unidad
medido
1 0.42 mg/L
2 0.56 mg/L
3 0.48 mg/L
Muestra 4 0.52 mg/L
5 0.53 mg/L ¿Los valores se encuentran
6 0.46 mg/L próximos?
7 0.50 mg/L
8 0.43 mg/L
PRECISION
TIPOS – SEGÚN EL NIVEL DE VARIABILIDAD QUE SE DESEA EVALUAR
Variabilidad mínima
INACAL PERÚ
Variabilidad máxima
REPETIBILIDAD PRECISION INTERMEDIA REPRODUCIBILIDAD

Concordancia entre los valores (reproducibilidad dentro del (Reproducibilidad entre
obtenidos en un corto periodo laboratorio). Concordancia entre laboratorios)
de tiempo ( 1 día o 1 corrida los valores obtenidos en un largo Concordancia entre los
analítica) periodo de tiempo ( varios meses) resultados obtenidos por
diferentes laboratorios.
Igual muestra, Procedimiento, Analista, sistema Diferentes analistas, calibrantes, lotes de reactivos,
de medición, condiciones de operación, lugar columnas, etc
PRECISION
CONSIDERACIONES
• La precisión esta relaciona con el error aleatorio
de un sistema de medición
INACAL PERÚ
• Es un componente de la incertidumbre de la
medición.
• Su estimado cuantitativo es la desviación estándar.
PRECISION
CRITERIOS PARA SU CUANTIFICACIÓN Los estudios de la desviación estándar
deben cubrir el alcance del método
• Mediante la estimación de la desviación estándar.
• Se debe de haber realizado previamente el
INACAL PERÚ
estudio de linealidad
• Se planea un diseño de experimentos para tener
en cuenta todas las variaciones en una medición
de rutina.
• El objetivo es determinar la variabilidad típica y
no la variabilidad mínima.
• Las replicas deben ser independientes, es decir
repetir el ensayo desde el pre-tratamiento de la
muestra
• El material usado para evaluar la precisión debe
ser similar a las muestras de ensayo, pero no
necesariamente MRC
• El numero de replicas varia, según las guías de
validación ( entre 6 a 15 replicas)
PRECISION
CUANTIFICACION – EXPRESION MATEMÁTICA
INACAL PERÚ
DESVIACIÓN ESTÁNDAR DESVIACION ESTANDAR COEFICIENTE DE

ABSOLUTO RELATIVO VARIACION
PRECISION
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
INACAL PERÚ
𝑛 2
Es recomendable estimar s a partir de
𝑖=1 𝑥𝑖 − 𝑥𝑚𝑒𝑎𝑛
𝑠= varios conjuntos pequeño de mediciones
𝑛−1 repetidas, para estimar de manera
representativa al s
DESVIACIÓN ESTÁNDAR AGRUPADA
- Poca cantidad de muestra
𝑛1 − 1 𝑠12+ 𝑛2 − 1 𝑠22+ ⋯ + 𝑛𝑘 − 1 𝑠𝑘2 - Muestras similares, pero no identicos
𝑠𝑝𝑜𝑜𝑙𝑒𝑑 =
𝑛1 + 𝑛2 + ⋯ + 𝑛𝑘 − 𝑘
DESVIACIÓN ESTÁNDAR AGRUPADA EXPRESADA EN RELATIVO
𝑛1 − 1 𝑅𝑆𝐷12 + 𝑛2 − 1 𝑅𝑆𝐷22 + ⋯ + 𝑛𝑘 − 1 𝑅𝑆𝐷𝑘2

𝑅𝑆𝐷𝑝𝑜𝑜𝑙𝑒𝑑 =
𝑛1 + 𝑛2 + ⋯ + 𝑛𝑘 − 𝑘
PRECISION
PLANIFICACION
1 2 3
INACAL PERÚ
Seleccionar item(s) Establecer el diseño Especificar criterio aceptación

MRs, muestras excedentes de La repetibilidad (sr) y la El criterio va a depender de cada
ensayo o blancos de muestra precisión intermedia (sl) se aplicación especifica, es decir
adicionados a diversas pueden determinar por debe ser adecuado para el uso.
concentraciones en todo el estudios separados o Se recomienda revisar las guias
intervalo de trabajo simultáneamente en un solo de validación
estudio.
13
PRECISION
ESTABLECER EL DISEÑO
ESTUDIOS SEPARADOS ESTUDIO SIMULTÁNEO

INACAL PERÚ
Desviación estándar de repetibilidad Desviación estándar de

• 6-15 replicas en condiciones de repetibilidad y precisión
repetibilidad intermedia simultaneo
• Estimar sr En condiciones de precisión
intermedia:
Desviación estándar de precision • 6-15 grupos de medidas
intermedia duplicadas obtenidas bajo
• 6-15 replicas en condiciones de condiciones de repetibilidad
precision intermedia en días/equipos diferentes
• Estimar sl para cada material.
• Evaluar ANOVA y obtener sr y sl
Fuente: Eurachem Guide: The Fitness for Purpose of Analytical Methods – A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics,
PRECISION
EJEMPLO 1: DE ESTUDIO POR SEPARADO
M1 hasta M8 puede ser iguales o de concentración y matriz similar pero no idénticas

INACAL PERÚ
Desviación estándar de repetibilidad

Diseño de experimento Días
Réplicas Cálculos
1 2 3 n-1 s2 x RSD^2
Muestras 1 7.1 7.1 7 2 0.00 7.067 0.000
2 6.9 6.7 6.8 2 0.01 6.800 0.000
M8 3 6.6 6.5 6.9 2 0.04 6.667 0.001
4 6.7 6.5 6.6 2 0.01 6.600 0.000
M7 5 7 6.9 6.6 2 0.04 6.833 0.001
……..
6 7.3 7.4 7.3 2 0.00 7.333 0.000

7 7.1 7.1 6.9 2 0.01 7.033 0.000
8 7 6.5 6.8 2 0.06 6.767 0.001
M2 sr 0.15 RSD pooled 0.091
M1 RSD% 9%
Días
k=8 y n=3
Día 1 Día 2 …….. Día 7 Día 8 𝑛1 − 1 𝑠12 + 𝑛2 − 1 𝑠22 + ⋯ + 𝑛𝑘 − 1 𝑠𝑘2
𝑛1 + 𝑛2 + ⋯ + 𝑛𝑘 − 𝑘
𝑛1 − 1 𝑅𝑆𝐷12 + 𝑛2 − 1 𝑅𝑆𝐷22 + ⋯ + 𝑛𝑘 − 1 𝑅𝑆𝐷𝑘2

𝑅𝑆𝐷𝑝𝑜𝑜𝑙𝑒𝑑 =
𝑛1 + 𝑛2 + ⋯ + 𝑛𝑘 − 𝑘
PRECISION
EJEMPLO 1 : DE ESTUDIO POR SEPARADO
Muestras control que no necesariamente es MRC

INACAL PERÚ
Desviación estándar de precisión intermedia

Mes C (µg/L)
Diseño de experimento 10-ene-22 0.68
25-ene-22 0.64
Muestras 18-feb-22 0.71
15-mar-22 0.62
MC 01-abr-22 0.70
MC 22-abr-22 0.89
19-jun-22 0.73
……..
03-jul-22 0.71
25-jul-22 0.71
MC x 0.71
s 0.08
MC RSD 0.11
Días 𝑠
%RSD 11 RSD =
𝑥
Mes 1 Mes 2…….. Mes 3Mes 8
𝑛 2
𝑖=1 𝑥𝑖 − 𝑥𝑚𝑒𝑎𝑛
𝑠=
𝑛−1
n=8
PRECISION
EJEMPLO 2: ESTUDIO SIMULTÁNEO

INACAL PERÚ
Desviación estándar de precisión intermedia

Operador / Curva / Reactivos
Grupo (Día)
1 2 3
1 7.1 7.1 7
2 6.9 6.7 6.8
3 6.6 6.5 6.9
4 6.7 6.5 6.6
5 7 6.9 6.6
6 7.3 7.4 7.3
7 7.1 7.1 6.9
8 7 6.5 6.8
USANDO ANOVA DE 1 FACTOR USANDO EXCEL
ANÁLISIS DE VARIANZA
Promedio de
Origen de las Suma de Grados de los Valor crítico
variaciones cuadrados libertad cuadrados F Probabilidad para F
𝑠𝑟 = 0.15 (2.2%)
Entre grupos 1.22625 7 0.17517857 7.37593985 0.00048371 2.6571966 𝑀𝑆𝑒 = 0.17517857
Dentro de
los grupos
𝑀𝑆𝑖 = 0.02375 𝑠𝑙 = 0.27 (3.9%)
(residuales) 0.38 16 0.02375
Total 1.60625 23
PRECISION
EJEMPLO 2: ESTUDIO SIMULTÁNEO
USANDO DESVIACION ESTANDAR AGRUPADA
INACAL PERÚ
Operador / Curva / Reactivos

Grupo (Día)
1 2 3
1 7.1 7.1 7 𝑛1 − 1 𝑠12 + 𝑛2 − 1 𝑠22 + ⋯ + 𝑛𝑘 − 1 𝑠𝑘2
2 6.9 6.7 6.8 𝑠𝑝𝑜𝑜𝑙𝑒𝑑 =
3 6.6 6.5 6.9
𝑛1 + 𝑛2 + ⋯ + 𝑛𝑘 − 𝑘
4 6.7 6.5 6.6
5 7 6.9 6.6 k=8 y n=3
6 7.3 7.4 7.3
7 7.1 7.1 6.9 𝑠𝑟 = 0.15 (2.2%)
8 7 6.5 6.8
𝑛1 − 1 𝑠12 + 𝑛2 − 1 𝑠22 + ⋯ + 𝑛𝑘 − 1 𝑠𝑘2

𝑛1 + 𝑛2 + ⋯ + 𝑛𝑘 − 𝑘
k=3 y n=8
𝑠𝑙 = 0.27 (3.9%)
PRECISION
FDA (USA) y la EMA (CE) dicen que

INACAL PERÚ
Se debe de evaluar que el sr y sl

el CV dentro y entre corridas debe
obtenido cumpla con los
ser <= 15% del valor nominal
criterios establecidos para el
(20% en el nivel de LoQ).
método
Eurachem e IUPAC no
VERIFICACIÓN SANTE (pesticidas) establecen
especifican los criterios de
aceptación de precisión
DE LA que el CV debe ser inferior al
20%.
PRECISIÓN
Normas estándares; APHA, Normas locales; NTP

EPA, ISO entre otros
INACAL PERÚ
VERACIDAD
02
20
INCERTIDUMBRE
DEFINICION – VIM 2.14

INACAL PERÚ
grado de concordancia entre la media de

un número infinito de valores medidos
repetidos y un valor de referencia.
• La veracidad es un parámetro no medible,

puesto que no es posible realizar un
número infinito de mediciones.
• El estimado cuantitativo de la veracidad es

el sesgo
VERACIDAD

INACAL PERÚ
SESGO ABSOLUTO SESGO RELATIVO RECUPERACION

EN PORENTAJE RELATIVA EN
ADICIONES
Simplemente una diferencia Diferencia dividida por el Diferencia dividida por el
valor de referencia valor de la adición
VERACIDAD
PLANIFICACION
1 2 3
INACAL PERÚ
Seleccionar el Valor Referencia Establecer el diseño Especificar criterio aceptación

a)MRC a) Establecer #replicas >=2 (mientras Se compara la diferencia (Xlab-
b) MR sin certificado, de un lab de mas grande es sl se recomienda
Xref) con respecto a la suma
referencia o items PT mayor replicas). Eurachem >=10
c) VR obtenido desde una b) Rango de tiempo del analisis de cuadratica de las incertidumbres
fortificación (cantidad conocida) las replicas, se recomienda dentro del LAB y de REF
d) Valor obtenido por un método de de un periodo de 1 mes
referencia (mejor al validado) 𝑥 − 𝑥𝑟𝑒𝑓 ≤ 𝑘 𝑢(𝑥)2 + 𝑢(𝑟𝑒𝑓)2
23
VERACIDAD
EJEMPLO – PCB EN GRASA DE CERDO

INACAL PERÚ
PCB 52: valor certificado = (12,9 ± 0,9) µg / kg.

Entonces:
𝑥𝑟𝑒𝑓 = 12,9 µg / kg
𝑢(𝑟𝑒𝑓)= 0,9 / 2 = 0,45 µg / kg.
La nota 3 declara un k = 2
VERACIDAD
EJEMPLO - CÁLCULOS
PCB 52: valor certificado = (12,9 ± 0,9) µg / kg.

INACAL PERÚ
𝑥𝑟𝑒𝑓 = 12,9 µg / kg
𝑢(𝑟𝑒𝑓)= 0,45 µg / kg
El laboratorio realiza 6 mediciones a lo largo de 3 semanas, obteniendo:

Valor
1 14.7
2 12.5
3 15.7
4 17
5 11.3 𝑥𝑙𝑎𝑏 = 14,4 µg / kg
6 15.3 𝑢(𝑙𝑎𝑏)= 0,79 µg / kg
x= 14.4
s= 1.9 𝑠
u(x) 0.79 𝑢 𝑥 =
𝑛
𝑛=6
VERACIDAD
EJEMPLO - VERIFICACIÓN
PCB 52: valor certificado = (12,9 ± 0,9) µg / kg. 𝑥𝑙𝑎𝑏 = 14,4 µg / kg

𝑥𝑟𝑒𝑓 = 12,9 µg / kg 𝑢(𝑙𝑎𝑏)= 0,79 µg / kg
INACAL PERÚ
𝑢(𝑟𝑒𝑓)= 0,45 µg / kg
𝑥 − 𝑥𝑟𝑒𝑓 ≤ 𝑘 𝑢(𝑥)2 + 𝑢(𝑟𝑒𝑓)2

14,4 − 12,9 ≤ 2 0,792 + 0,452
1,5 ≤ 1,8 los valores medidos y el valor de
referencia son consistentes entre sí
(12% de Vref)
dentro de sus respectivas
incertidumbres.
VERACIDAD
EJEMPLO - VERIFICACIÓN
𝑥 − 𝑥𝑟𝑒𝑓 ≤ 𝑘 𝑢(𝑥)2 + 𝑢(𝑟𝑒𝑓)2

INACAL PERÚ
2,3 ≤ 1,8
Si no se cumple la condición, es decir d> U (d), entonces se intenta encontrar la causa del sesgo y
reducirlo o eliminarlo.
Si no es posible una reducción o una eliminación del sesgo, el resultado de la

Observaciones medición debe corregirse por sesgo y la incertidumbre asociada con el sesgo debe
incluirse en el evaluación de la incertidumbre.
Fuente: ISO Guide 33

VERACIDAD
EJEMPLO 2 – CONTAMINANTES EN AGUA
El laboratorio realiza 10 mediciones a lo largo de

4 semanas, obteniendo:
INACAL PERÚ
𝑠
𝑥𝑙𝑎𝑏 7,88 ng/L 𝑢 𝑥 =
𝑥𝑟𝑒𝑓 7,4 ng/L 𝑛
b 0,48 ng/L
relative b 6,5%
u(lab) 0,47 ng/L Resultado
U(ref) 1,0 satisfactorio
u(ref) 0,5 ng/L
zeta= 0,71
INACAL PERÚ
EXACTITUD
03
29
EXACTITUD
La exactitud de una resultado de medición indica su proximidad al valor real y caracteriza a un

resultado individual
INACAL PERÚ
𝑦 =𝜇+𝛿+𝜀
Error
aleatorio
Valor
verdadero Error sistemático
EXACTITUD
INACAL PERÚ
INCERTIDUMBRE
DEFINICIÓN – VIM 2.26
Parámetro no negativo que caracteriza la
dispersión de los valores atribuidos a un
INACAL PERÚ
mensurando, a partir de la información

utilizada
Ejemplo
• Resultado de la medición: 65 μg/g
• Incertidumbre estimada: ± 25 μg/g
C, μg/g
40 μg/g 65 μg/g 90 μg/g

INCERTIDUMBRE - ENFOQUES
Enfoques
INACAL PERÚ
Enfoque Intra- Enfoque

laboratorio interlaboratorio
Enfoque de Enfoque de
Enfoque de Enfoque de
validación de un validación entre
modelamiento ensayos de aptitud
laboratorio laboratorios
Enfoque empírico
Enfoques basados en una larga experiencia
Fuente: Basado en la publicación de Eurolab 1-2007

INCERTIDUMBRE - GUÍAS
ensayos de aptitud
validación de un
Validación entre
modelamiento
laboratorios
laboratorio
INACAL PERÚ
Guías
general
Guide to the expression of uncertainty in X X
measurement (GUM)
EURACHEM / CITAC (2012), Quantifying X X X
uncertainty in analytical measurement
EUROLAB Technical Report No. 1/2007, X X X X X
Measurement Uncertainty
revised:Alternative appoaches to uncertainty
evaluation
EUROLAB Technical Report No. 1/2006, X X X X
Guide to the Evaluation of Measurement
Uncertainty for Quantitative Test Results
INCERTIDUMBRE - GUÍAS
ensayos de aptitud
validación de un
Validación entre
modelamiento
laboratorios
laboratorio
Guías
general
INACAL PERÚ
EA 4/16 (2004), Guidelines on the X X X X X

expression of uncertainty in quantitative
testing
NORDTEST Technical Report 537 (2003), X X X
Handbook for calculation of
measurement uncertainty in
environmental laboratories
ISO 5725 Accuracy (trueness and X
precision) of measurement methods and
results (6 parts)
ISO/TS 21748 Guide to the use of X X X
repeatability, reproducibility and
trueness estimates in measurement
uncertainty estimation
TITULAR DE LA EXPOSICIÓN
www.inacal.gob.pe/metrologia/categoria/guias-direccion-metrologia-dm
INACAL PERÚ
INCERTIDUMBRE
ENFOQUE DE MODELAMIENTO
X1
X2
X11
X21
X12
X41 Y
Paso 1 Especificar el mensurando
INACAL PERÚ
X42
X3
X4
𝒀 = 𝒇(𝑿𝟏 , 𝑿𝟐 , 𝑿𝟑 , 𝑿𝟒 ) Identificar las fuentes de

incertidumbre Paso 2
Cuantificar los componentes
Paso 3 de la incertidumbre
Calcular la incertidumbre
Paso 4
combinada
𝑁 Calcular la incertidumbre
2 Paso 5
𝜕𝑓 expandida
𝑢𝑐2 (𝑦) = 𝑢2 (𝑥𝑖 )
𝜕𝑥𝑖
𝑖=1
INCERTIDUMBRE
EJEMPLO: MEDICION DE SOLIDOS SUSPENDIDOS TOTALES EN AGUA
INACAL PERÚ
INCERTIDUMBRE
EJEMPLO
Paso 1
INACAL PERÚ
Paso 2
Paso 3
Paso 4
Paso 5
INSTITUTO NACIONAL DE CALIDAD 𝑇𝐶 × ∆𝑇
2
∆𝐸(𝑚𝑎𝑥 )
2
𝑛 × 𝐸. 𝑀. 𝑃. (𝑚𝑎𝑥 )
2
∆𝐼𝑒𝑐𝑐,𝑗
2
𝑚𝑎𝑥
𝑢 𝑤𝑖 = 𝑎+ 𝑏+ + + + × 𝑅2
INCERTIDUMBRE 12 𝑀𝑎𝑥 × 12 𝑀𝑎𝑥 × 3 𝐿𝑒𝑐𝑐 × 3
EJEMPLO
Paso 1
INACAL PERÚ
Paso 2
Paso 3
Paso 4
Paso 5
INCERTIDUMBRE
EJEMPLO
𝑢 𝑉 = 𝑢2 𝑉𝑐𝑎𝑙_𝑉 + 𝑢2 𝛿𝑡𝑒𝑚𝑝_𝑉 + 𝑢2 𝛿𝑙𝑒𝑐𝑡_𝑉

Paso 1
INACAL PERÚ
2 2
𝑈 2
𝑉 × ∆𝑇 × 𝛾𝐻2 𝑂 𝑅
𝑛
𝑢 𝑉 = + +
𝑘 12 12
Paso 2
Paso 3
Paso 4
Paso 5
INCERTIDUMBRE
EJEMPLO
Paso 1
INACAL PERÚ
Paso 2
Paso 3
Paso 4
Paso 5
INCERTIDUMBRE
ENFOQUE EMPIRICO
ENFOQUE DE VALIDACION
INACAL PERÚ
• Replicas de • MRC
muestra control • Ensayos de
aptitud ENFOQUE DE ENSAYOS DE APTITUD
• Estudio de
recuperaciones
ENFOQUE DE VALIDACION ENTRE
LABORATORIOS
sR: desviación estándar
agrupada obtenido en
el interlaboratorio
INCERTIDUMBRE
ENFOQUE EMPIRICO - EJEMPLO
Determinación del contenido de proteínas en productos alimenticios mediante fotometría por
el método Kjeldahl
INACAL PERÚ
𝑈 = 2,3 𝑔/100𝑔 (k=2)

𝑢𝑐 = 1,14 𝑔/100𝑔
Seman Resulta 𝑈𝑟𝑒𝑙 10 %
a do
g/100g
3 18,1
Valor pormedio
5 20,5 MRC (g/100g)
(g/100g)
sesgo ucer
11 18,3
14 19,1 26,3 26,9 0,6 0,35
15 19,3 26,3 27,2 0,9 0,35
27 20,2 19,6 20,1 0,5 0,3
34 19,7 19,6 20,4 0,8 0,3
41 19,5
0,717635 0,32596012
42 18,6 u(segso) 0,78819414
48 20,1
𝑢(𝑏𝑖𝑎𝑠) = 0.788 𝑔/100𝑔

𝑢(𝑅𝑤) = 0.819 𝑔/100𝑔
ROBUSTEZ
04
45
ROBUSTEZ
CONCEPTO
El término robustez se refieren a la parámetros del método factores ambientales

capacidad de un método analítico de
INACAL PERÚ
• Por ejemplo: • Por ejempLo:

no verse afectado por pequeñas • Tamaño del poro del • Temperatura ambiente
variaciones (en parámetros del método filtro • Humedad del aire,
y factores ambientales) y caracteriza su • Pureza del reactivo • Presión, etc
confiabilidad durante su uso normal. • composición de la fase
móvil
• Antigüedad de la
columna
• Temperatura del horno
• Tiempo de extracción,
etc
Si es que estas variaciones no se controlan

podrían tener un efecto significativo sobre el
resultado de medición ( o en el parámetro
de desempeño del método)
ROBUSTEZ
EJEMPLO DE FACTORES QUE PUEDEN INFLUENCIAR EN LA ROBUSTEZ DEL MÉTODO
INACAL PERÚ
Parámetros LC
pH
Concentración de aditivos en el
eluyente Parámetros para la muestra y preparación de muestra
Parámetros para MS
Cantidad de solvente organico en el
Tiempo de extracción del analito
eluyente
Presión / velocidad de flujo del gas nebulizador
Temperatura de la columna Composición del solvente de inyección
Configuracion de la fuente de iones
Velocidad de flujo del eluyente Efecto de matriz
Antigüedad de la columna
ROBUSTEZ
PASOS PARA EVALUAR LA ROBUSTEZ DE UN MÉTODO
Realizar las
INACAL PERÚ
a) Definir los b) Elegir una de las

mediciones de las
parámetros opciones para
combinaciones en
(factores) evaluar robustez
orden aleatorio
Las mas conocidas son:
• Enfoque de una factor a la vez Comparar con el

• Diseño experimental criterio establecido
en la validación Calcular los efectos
(repetibilidad,
recuperación u otro)
ROBUSTEZ
ENFOQUE DE UNA FACTOR A LA VEZ
• Es simple y se evalua un factor a la vez (para cada direccion)
• 2 niveles por factor (+), (-)
INACAL PERÚ
Orden del Variable de

N° Experiments Factor A Factor B Factor C
experimento Respuesta
1 3 O O + Y1 O : Valor optimo
2 6 O O - Y2 (+) : Valor superior al valor optimo
3 5 O + O Y3 (-) : valor inferior al valor optimo
4 1 O - O Y4
5 4 + O O Y5
6 2 - O O Y6
7 7 O O O Y7
Se evalúa la desviación con respecto al valor optimo

ROBUSTEZ
DISEÑO EXPERIMENTAL - FULL FACTORIAL DESIGN
Supuesto: El número de factores es entre 2 y 4. Es posible realizar varios experimentos.
𝑛 = 2𝑘 Construir la tabla que contendrá todas las posibles combinaciones
INACAL PERÚ
Variable de
n: # de experimentos N° experimento Factor A Factor B Factor C
Respuesta
k: # de factores 1 + + + Y1
2 + + - Y2
3 + - + Y3
Ejemplos: 4 + - - Y4
5 - + + Y5
6 - + - Y6
• 2 factores en 4 experimentos, 7 - - + Y7
• 3 factores en 8 experimentos 8 - - - Y8
• 4 factores en 16 experimentos (+) : Valor superior al valor optimo

(-) : valor inferior al valor optimo
2 niveles por factor (+) , (-)
𝑌𝐴+ 𝑌𝐴−
𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜𝐴 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = −
#𝐴 + #𝐴 −
𝑌𝐴+ 𝑌𝐴−
𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜𝐴 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜 = −
#𝐴 + #𝐴 −
ROBUSTEZ
EJEMPLO – ENFOQUE DE UN FACTOR A LA VEZ
Datos:
Orden A B C Respuesta
INACAL PERÚ
• Factor 1: (9.6 ± 0.2) pH

• Factor 2: (5.0 ± 0.2) mmol/L N° Experiments Conc.
Temperatur Tiempo de
experimento pH Aditivo en
• Factor 3 : (5.0 ± 0.2) °C eluyente
a columna retención
• tiempo de retención esperada: ± 0,5 min 1 3 O O + 7.95

2 6 O O - 8.13
3 5 O + O 8.12
4 1 O - O 7.72
𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜𝐴+ = 𝑌𝐴+ − 𝑌𝐴0 = 8,32 − 8,03 = 0,29 min 5 4 + O O 8.32
6 2 - O O 9.82
𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜𝐴− = 𝑌𝐴− − 𝑌𝐴0 = 9,82 − 8,03 = 1,79 min 7 7 O O O 8.03
El efecto del pH por debajo del valor optimo es significativo y este debe de
Conclusión
controlarse con exactitud para este método o tomar otras medidas para no
afectar el desempeño del método.
ROBUSTEZ
EJEMPLO – DISEÑO EXPERIMENTAL
A B C Response 1
Datos: Orden de Conc. Temp. Tiempo
N° experimento
INACAL PERÚ
• Factor 1: (9.6 ± 0.2) pH medicion Aditivo Columna retencion

• Factor 2: (5.0 ± 0.2) mmol/L pH [mmol/L] [°C] [min]
• Factor 3 : (5.0 ± 0.2) °C 1 3 + + + 8.31
• tiempo de retención esperada: 1 min 2 4 + + - 8.1
3 2 + - + 7.24
4 5 + - - 7.43
5 6 - + + 8.32
6 7 - + - 8.92
7 1 - - + 9.84
8 8 - - - 9.93
𝑌𝐴+ 𝑌𝐴− 8,31 + 8,1 + 7,24 + 7,43 8,32 + 8,92 + 9,84 + 9,93
𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜𝐴 = − = − = −1,48 min
#𝐴 + #𝐴 − 4 4
El efecto del pH es significativo para el TR, ya que la disminuicion del pH impacta

Conclusión
en el aumento del TR del analito. El metodo no es robusto para pH +/-0.2 , debe
de tomarse otras medidas para no afectar el desempeño del método.
RESULTADOS DE
05 LA VALIDACIÓN
53
RESULTADOS DE LA VALIDACION
INACAL PERÚ
PROCEDIMIENTO INFORME DE CRITERIOS DE

VALIDADO VALIDACION CONTROL DE CALIDAD
Preliminarmente se contaba Preliminarmente se cuenta
Se establece a partir de los
con un procedimiento en con un plan de validación
resultados de la validación
borrador
• la documentación del procedimiento aprobado debe

limitar la posibilidad de introducir cambios
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accidentalmente.
• Permite el uso adecuado del método
Recomendaciones
ISO 78-2:1999 Chemistry – Layouts for standards - Part 2:

Methods of chemical analysis, ISO Geneva.
PROCEDIMIENTO
Establece directrices para documentar un metodo
VALIDADO
Preliminarente se contaba
con un procedimiento en
borrador
Plan de Informe de
validación validación
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Debe ser claro y contener: El informe debe contener toda la

información relevante para la
• Objetivo de la validación correcta interpretación de los
• Planificación de los resultados:
experimentos para cada • Identificación del método
parámetro de desempeño a • Alcance (muestras,
evaluar concentración)
• Rango de concentración • Resumen del plan experimental
• Numero de matrices • Materiales usados
INFORME DE
• Limite de la incertidumbre • Tratamiento estadístico de los
VALIDACION • Criterio de aceptación de los datos
Preliminarmente se cuenta resultados esperados • Resultados y Conclusiones
con un plan de validación (establecidos por lo general
en guias, directivas o normas
El contenido muchas veces esta definido en
directrices o en guias estandares
Para comprobar que el método permanece bajo control, es

decir, se comporta de la manera esperada, deben ponerse en
INACAL PERÚ
marcha controles específicos
Controles internos Controles externos
• El laboratorio aplica • Utiliza otros mecanismos distintos a

procedimientos propios para la los del propio laboratorio
supervisión continua de los
resultados de medición para dar
CRITERIOS DE confiabilidad al reporte de los
CONTROL DE CALIDAD resultados
Se establece a partir de los

resultados de la validación
Permite dar
CONTROL DE CALIDAD INTERNO Soluciones estándares
trazabilidad a las
(S0, S1, S3)
mediciones
Consiste en correr las muestras de ensayo
juntos con los materiales de control
Evalúa precisión del
Análisis de duplicados
INACAL PERÚ
método
Muestras de ensayo
Análisis de replicas Evalúa repetibilidad
(T1, T2, T3)
Análisis de muestras
Evalúa precisión
ciegas
Ejemplo de una corrida analitica Permite corregir el

analito o monitorear el
Blanco de muestra (BL)
desempeño del
método a bajas conc.
Material de control in- Evalúa estabilidad del

house (QC) método
Evalúa estabilidad del

MRC (QC)
método
Fuente: NT TR 569 edition 5.1

GRAFICAS DE CONTROL DE CALIDAD
Se recomienda el uso de gráficos de control para monitorizar los resultados de los materiales de control
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Graficas de Control
X
TIPOS
Graficas de Control
R (Rangos)
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Graficas de Control • Monitorea sesgo

X • Distribución del valor del
material control alrededor de un
valor esperado
Tipos:
• Cartas del valor del blanco: Comportamiento Blanco –
detectar errores (cuando se tienen analitos a muy baja
concentración LoC)
• Cartas de recuperación: MRC , In-house, muestras
fortificadas; evalua efecto de matriz, desempeño del
sistema
• Pendiente e intercepto de curva de calibrado,
monitoreado diariamente
INACAL PERÚ
Graficas de Control
R (Rangos)
Demostrar el control de la repetibilidad
• Utilizado para el análisis de duplicados de

muestras
• Se evalúa el rango en relativo porcentual para
concentraciones altas y el rango en absoluto
para concentraciones bajas
CONTROL DE CALIDAD EXTERNO
• Consiste en demostrar el desempeño del laboratorio , mediante su participacion en ensayos de
aptitud
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• Se puede utilizar para realizar el seguimiento del desempeño del método en comparación con
laboratorios similares
• Se puede evaluar reproducibilidad y sesgo
Informes de ensayo de aptitud:

𝑠𝑙 (𝑙𝑎𝑏) ≤ 𝜎(𝑝𝑡)
- Valor asignado
- Incertidumbre del valor
asignado
- Desviación estándar del 𝑥𝑙𝑎𝑏 − 𝑥𝑝𝑡 ≤ 𝑘 𝑢(𝑥𝑙𝑎𝑏 )2 + 𝑢(𝑥𝑝𝑡 )2
ensayo de aptitud
REFERENCIAS
SERIES DE LAS ISO 5725
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REFERENCIAS
IUPAC FDA – CAMPO FARMACEUTICO
INACAL PERÚ
REFERENCIAS
FDA – CAMPO FARMACEUTICO USP – METODOS PHARMACOPEA
INACAL PERÚ
REFERENCIAS
OMCL-RED EUROPEA DE FARMACOPEA EUROPEA
EMA – AGENCIA EUROPEA DE
MEDICAMENTOS LABORATORIOS OFICIALES DE
CONTROL DE MEDICAMENTOS
INACAL PERÚ
REFERENCIAS
GUIA SANTE – PARA PESTICIDAS CEN – VALIDACION DE METODOS EURACHEM
AMBIENTALES
INACAL PERÚ
REFERENCIAS
Red Europea de Institutos de Ciencias Forenses (ENFSI) - METODOS PARA ANALISIS FORENCE
INACAL PERÚ
REFERENCIAS
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REFERENCIAS
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REFERENCIAS
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REFERENCIAS
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REFERENCIAS
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REFERENCIAS
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REFERENCIAS
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GRACIAS
Rocio Taquire
Especialista del laboratorio de Química
Zambrano Organica
EXPORTADOR
76

Validacion de Métodos Analiticos - Parte 2

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Validacion de Métodos Analiticos - Parte 2

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INSTITUTO NACIONAL DE CALIDAD

RESUMEN DE UN PROCESO DE VALIDACIÓN

Veracidad Exactitud Robustez

grado de concordancia entre las indicaciones o los

valores medidos obtenidos en mediciones repetidas

REPETIBILIDAD PRECISION INTERMEDIA REPRODUCIBILIDAD

DESVIACIÓN ESTÁNDAR DESVIACION ESTANDAR COEFICIENTE DE

DESVIACIÓN ESTÁNDAR AGRUPADA EXPRESADA EN RELATIVO

𝑛1 − 1 𝑅𝑆𝐷12 + 𝑛2 − 1 𝑅𝑆𝐷22 + ⋯ + 𝑛𝑘 − 1 𝑅𝑆𝐷𝑘2

Seleccionar item(s) Establecer el diseño Especificar criterio aceptación

ESTUDIOS SEPARADOS ESTUDIO SIMULTÁNEO

Desviación estándar de repetibilidad Desviación estándar de

M1 hasta M8 puede ser iguales o de concentración y matriz similar pero no idénticas

Desviación estándar de repetibilidad

6 7.3 7.4 7.3 2 0.00 7.333 0.000

𝑛1 − 1 𝑅𝑆𝐷12 + 𝑛2 − 1 𝑅𝑆𝐷22 + ⋯ + 𝑛𝑘 − 1 𝑅𝑆𝐷𝑘2

Muestras control que no necesariamente es MRC

Desviación estándar de precisión intermedia

Muestras control que no necesariamente es MRC

Desviación estándar de precisión intermedia

Operador / Curva / Reactivos

𝑛1 − 1 𝑠12 + 𝑛2 − 1 𝑠22 + ⋯ + 𝑛𝑘 − 1 𝑠𝑘2

FDA (USA) y la EMA (CE) dicen que

Se debe de evaluar que el sr y sl

Normas estándares; APHA, Normas locales; NTP

DEFINICION – VIM 2.14

grado de concordancia entre la media de

• La veracidad es un parámetro no medible,

• El estimado cuantitativo de la veracidad es

CUANTIFICACION – EXPRESION MATEMÁTICA

SESGO ABSOLUTO SESGO RELATIVO RECUPERACION

Seleccionar el Valor Referencia Establecer el diseño Especificar criterio aceptación

EJEMPLO – PCB EN GRASA DE CERDO

PCB 52: valor certificado = (12,9 ± 0,9) µg / kg.

PCB 52: valor certificado = (12,9 ± 0,9) µg / kg.

El laboratorio realiza 6 mediciones a lo largo de 3 semanas, obteniendo:

PCB 52: valor certificado = (12,9 ± 0,9) µg / kg. 𝑥𝑙𝑎𝑏 = 14,4 µg / kg

𝑥 − 𝑥𝑟𝑒𝑓 ≤ 𝑘 𝑢(𝑥)2 + 𝑢(𝑟𝑒𝑓)2

𝑥 − 𝑥𝑟𝑒𝑓 ≤ 𝑘 𝑢(𝑥)2 + 𝑢(𝑟𝑒𝑓)2

Si no es posible una reducción o una eliminación del sesgo, el resultado de la

Fuente: ISO Guide 33

EJEMPLO 2 – CONTAMINANTES EN AGUA

El laboratorio realiza 10 mediciones a lo largo de

La exactitud de una resultado de medición indica su proximidad al valor real y caracteriza a un

mensurando, a partir de la información

40 μg/g 65 μg/g 90 μg/g

Enfoque Intra- Enfoque

Fuente: Basado en la publicación de Eurolab 1-2007

EA 4/16 (2004), Guidelines on the X X X X X

𝒀 = 𝒇(𝑿𝟏 , 𝑿𝟐 , 𝑿𝟑 , 𝑿𝟒 ) Identificar las fuentes de

𝑢 𝑉 = 𝑢2 𝑉𝑐𝑎𝑙_𝑉 + 𝑢2 𝛿𝑡𝑒𝑚𝑝_𝑉 + 𝑢2 𝛿𝑙𝑒𝑐𝑡_𝑉

𝑈 = 2,3 𝑔/100𝑔 (k=2)

𝑢(𝑏𝑖𝑎𝑠) = 0.788 𝑔/100𝑔

El término robustez se refieren a la parámetros del método factores ambientales

• Por ejemplo: • Por ejempLo:

Si es que estas variaciones no se controlan

a) Definir los b) Elegir una de las

Las mas conocidas son:

• Enfoque de una factor a la vez Comparar con el

Orden del Variable de

Se evalúa la desviación con respecto al valor optimo

• 4 factores en 16 experimentos (+) : Valor superior al valor optimo

• Factor 1: (9.6 ± 0.2) pH