Validación de Métodos Analíticos

María Soledad Perlo 1

 Conceptos básicos y Definiciones

Objetivo de una validación: demostrar que el método es adecuado para el fin previsto y que los
resultados obtenidos son fiables, exactos y reproducibles.

VALIDACIÓN DE PROCESOS: Evidencia documentada la cual proporciona un alto grado de

seguridad que un proceso específico resultará consistentemente en un producto que reúne sus
especificaciones pre-determinadas y sus características de calidad

VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO: comprende una serie de ensayos documentados,

previamente definidos, con los cuales es desafiado el método analítico, a fin de que el resultado
aportado por el mismo sea confiable.

El procedimiento de validación de un método analítico será tanto más exitoso, cuanto mejor
desarrollado se encuentre el método analítico.

La Validación alcanza no solamente a los Principios Activos, sino a los componentes que de alguna
manera impactan en la calidad del producto final (conservantes por ejemplo).
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 ¿Por qué Validamos?

Definición:

 Proporciona la evidencia que indica que el método es adecuado para el fin

propuesto.

 Disminuye los costos asociados a repeticiones innecesarias.

 Imprescindible para la transferencia de métodos entre departamentos o entre filiales

de una corporación.

 Requisito comercial y regulatorio

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 Clasificación de los Métodos Según USP

 Categoría I: Métodos Analíticos para cuantificación de macro componentes en

Ingredientes activos, o Productos Medicinales.

 Categoría II: Determinación de impurezas o trazas en Ingredientes activos, o

Productos Medicinales .

 Categoría III: Determinación de características particulares, como disolución,

perfil de liberación, Uniformidad de contenido, etc.

 Categoría IV: Ensayos específicos. Por ejemplo tamaño de partículas, Difracción

de rayos x, rotación específica etc.
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 Clasificación

 Validación de métodos analíticos. (Se ve más adelante)

 Verificación métodos compendiales: USP <1126>

No es necesario validarlos, pero sí debe demostrar: selectividad, la idoneidad del sistema y la precisión. En SSRR,
se agrega LC y LD.

 Revalidación:
Demostración de que un método previamente validado continúa siendo fiable luego de diferentes posibles casos:
- Actualización del método
- Modificación de parámetros analíticos o en los parámetros del método de análisis.
- Paso del tiempo
- Cambio en la muestra
- Cambio en proveedores o en el proceso de síntesis del API
- Cambio de laboratorio, de instrumentos o materiales
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Etapas de la Validación 6
 Etapas de una Validación

 Protocolar

 Experimental

 Evaluación de Resultados

 Documental

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 Etapas de una Validación
 Protocolar:
El protocolo se elabora previo a la ejecución de la Validación. En el que deberá quedar
establecido:
 Los ensayos a realizar en función del procedimiento analítico a ser validado.
 Las fórmulas de cálculo que sea necesario aplicar para la obtención de los resultados
en los diferentes ensayos.
 Los criterios de aceptación para cada uno de los ensayos que permitan evaluar la
conformidad de los resultados.

Antes de comenzar con la fase Experimental el protocolo debe estar: Redactado, revisado
y aprobado (circuito de firmas concluido).

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 Etapas de una Validación

 Experimental: En esta fase se realizan todos los experimentos conforme a lo

detallado en el Protocolo.
En ésta fase se deberá contar con los recursos previstos en la fase de redacción del
protocolo.
Será gestionado como una desviación: Resultados que se encuentren fuera del criterio de aceptación.

 Evaluación de Resultados: En esta fase se evalúan y documentan los resultados que

provienen de la fase experimental.

 Documental: En esta fase se redactará el informe final con los resultados y las
conclusiones correspondientes. El informe final debe ser redactado, revisado y
aprobado (circuito de firmas concluido).

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Validación de Métodos Analíticos
Ensayos a Realizar 10
 Ensayos a Realizar
ENSAYO CUANTITATIVO
TEST DE IMPUREZAS
TIPO DE MÉTODO -Disolución (medida)
IDENTIFICACIÓN
Cuantitativo Límite -Contenido/Potencia
Características
Exactitud - + - +
Precisión
-Repetibilidad - + - +
-Precisión intermedia
- + - +
Selectividad + + + +
Límite detección - - + -
Límite cuantificación - + - -
Linealidad - + - +
Rango - + - +
Robustez - + - +
Compatibilidad de filtros - + - +
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Estabilidad de patrón y
 SELECTIVIDAD
Definición: la selectividad se demuestra:

 Identificación: Comparar el analito con un material de referencia.

1. Tiempos de retención: Se evalúa la diferencia entre los tr del analito en el Standard y en la muestra.
2. Espectro UV del analito en el Standard y en la muestra presentan los mismos máximos de absorción.

 Demostrar la no interferencia de los excipientes: Demostrar la resolución o no interferencia entre las siguientes
soluciones:
Inyecciones individuales de:
Blanco
Standard
Placebo
Muestra

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 SELECTIVIDAD
Blanco Standard

Placebo Muestra

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 LINEALIDAD

Rango: intervalo entre la concentración superior e inferior de analito para el que se ha demostrado que el
método cumple las especificaciones establecidas de linealidad, precisión y exactitud.

Rango de trabajo:
 80 % – 120 % ( Val API y PT)
 70 % – 130 % (UC)
 20 % – 120 % (TD)
 LR -120 % del Teórico (SSRR)

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 LINEALIDAD

Linealidad: la capacidad del método para proporcionar resultados

que son proporcionales, directa o inversamente, a la concentración
de un analito dentro de un rango establecido

Preparar las siguientes soluciones

 Al menos 5 niveles de concentración.
 Solo aplica a la solución de referencia

¿Para qué realizamos la linealidad?

Es necesaria para trabajar con una sola concentración de estándares.

¿Qué pasa si el método no es lineal?

Será necesario trabajar con estándares múltiples o curvas de calibración.

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 LINEALIDAD

Análisis de los resultados Criterios de aceptación

Coeficiente de correlación (r):
 Determinación de la recta de calibrado:
≥ 0,999 (Valoración)
Se calculará la recta de regresión: y= a + bx
Las rectas obtenidas deben ser paralelas entre sí, lo que se comprobará mediante el análisis ≥ 0,990 (TD y SSRR)
de ANOVA.
Luego se agruparan y se generará una única recta.

 Evaluación de la linealidad: Coeficiente de Variación:

Análisis de los CV de los factores de respuesta para cada una de las concentraciones. CV ≤ 2% (Valoración)
CV ≤ 5% (TD y SSRR)

 Significación estadística de la pendiente (b): Análisis de la pendiente (b):

La pendiente b representa la sensibilidad del método analítico. texp > ttab (Refleja que cumple con el
Una mayor pendiente se asocia a una mayor sensibilidad del método analítico. test de Student)
El intervalo de confianza NO debe
incluir a cero. (La pendiente debe ser
significativamente diferente a cero)

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 LINEALIDAD

Análisis de los resultados Criterios de aceptación

 Test de proporcionalidad: Análisis de la ordenada al origen
Permite evaluar si la recta pasa por el origen de ordenadas. (a):
El valor de a, ordenada en el origen, indica el error sistemático del método. texp > ttab (Refleja que la ordenada al
El caso ideal es que sea igual a cero.
origen es estadísticamente igual a
cero).
El intervalo de confianza de la
ordenada debe incluir el cero.

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 EXACTITUD

Definición:
La Exactitud de un método analítico expresa el grado de
concordancia entre el valor hallado y el valor verdadero
(aceptado como referencia).
Rango de trabajo: Iguales que los del rango

Preparación de la muestra:
MP al 80% + Placebo Buena Exactitud Exactitud Pobre
MP al 100% + Placebo
MP al 120% + Placebo
La evaluación del ensayo de exactitud se realizará con el cálculo del porcentaje de recuperación del
analito en la muestra problema.

Demuestra que somos capaces de recuperar lo que realmente hay de muestra (Materia prima).

Criterios de aceptación: Todos los porcentajes de recuperación individuales deben encontrarse en el

intervalo establecido de acuerdo a lo anteriormente indicado.
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 PRECISIÓN

Definición: es el grado de concordancia (grado de dispersión) entre una

serie de resultados obtenidos cuando el método se aplica repetidamente a
una misma muestra homogénea bajo condiciones establecidas.

Buena Precisión Poca Precisión

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 PRECISIÓN

Repetibilidad del método:

 6 determinaciones independientes.
 Concentración: Valoración y TD: 100% de la cc. de analito.
 Iguales condiciones operativas (analista, laboratorio, aparatos, reactivos)

Precisión intermedia:
 6 determinaciones independientes (estándar de referencia o recta de calibrado independiente)
 Concentración: Valoración y TD: 100% de la cc. de analito.
 Igual Muestra y Laboratorio.
 Condiciones operativas diferentes: Dos días diferentes, dos analistas (cada día). Pudiendo variar aparatos y
reactivos.

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 ESTABILIDAD

Definición: Es el período en el cual las soluciones preparadas pueden utilizarse y debe ser establecido
ya que la degradación de algún componente de la solución (inclusive excipientes) puede afectar la
exactitud y la especificidad del método.

Procedimiento:
 Patrones y Muestras
Condiciones: Matraz y Viales (fraccionar en viales separados)
Expuesto o protegido de la Luz
Temperatura: 22 ± 3ºC y 5 ± 3ºC
Tiempo cero, 24hs, 48 hs, 72hs y 96 hs.

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 COMPATIBILIDAD DE FILTROS

Objetivo : determinar cuál es el material más adecuado para la filtración de patrones y muestras de forma
previa a su análisis.

Procedimiento:
 Patrones y Muestras
Condiciones: Tamaño de poro: 0,20 y 0,45 µm
Tipos de membranas: Nylon, PTFE, PVDF,
CR

Criterio de Aceptación:
 El porcentaje de diferencia para cada solución filtrada debe ser ≤ 2,0%
 No deben aparecer picos extra ni desaparecer aquellos que si aparezcan al comparar la línea base de las soluciones filtradas y sin
filtrar.

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 ROBUSTEZ

Definición: es la capacidad de un método de continuar dando datos precisos y exactos

cuando es sujeto a ligeras variaciones, producidas deliberadamente, de las condiciones
del trabajo, y es un indicio de la fiabilidad del método en las condiciones de trabajo.

Procedimiento: se realizan haciendo ligeras variaciones en distintos parámetros respecto a los fijados
en el método analítico.

Criterio de aceptación: Se evalúa la influencia de los cambios en:

 Especificidad del método
 Test de idoneidad (resolución, simetría, platos, área)
 Cuantificación del analito en la muestra.

Si las medidas son susceptibles de variaciones debidas a las condiciones analíticas, éstas deben ser
adecuadamente controladas y debe incluirse un párrafo de precauciones en el procedimiento.

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 LÍMITE DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN

Límite de cuantificación (LC): mínima concentración de analito que puede ser cuantificada
en la muestra con una adecuada precisión y exactitud.

Límite de detección (LD): mínima concentración de analito en la muestra que puede ser
detectada, aunque no necesariamente cuantificada, bajo las condicione experimentales del método.

Límite de Reporte (LR): menor concentración de impureza, por debajo de la cual no se

considera necesario reportar resultados.
 BIBLIOGRAFIA

Los criterios y recomendaciones establecidos en el procedimiento GCD-208/3 se

basan en:

 Anexo 15 “Cualificación y validación”, Eudralex EU GMP

 La guía ICH Q2 (R1) “Validation of Analytical Procedures”.
 USP <621> Chromatography.
 USP <1225> Validation of compendial procedures.
 USP <1226> Verification of compendial procedures.
 Ph. Eur. 2.2.46 Chromatographic separation techniques.

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 PREGUNTAS

ESPECIFICIDAD Y BALANCE DE MASA

PREGUNTAS?