UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA

CARRERA DE BIOTECNOLOGÍA

Análisis de la actividad enzimática de la enzima invertasa

Analuisa Javier, Aucapiña Grace, Barreros Santiago, Caiza Alex, De La Cruz Steven,
Peralta Oscar, Guamán Mary, Tubón Michelle, Chango Raquel, Peñafiel Darwin, Chiriboga
Viviana,
1. RESUMEN
En el presente informe se realiza un análisis con datos estadísticos de la actividad enzimática
de la enzima invertasa, llevando a cabo un ensayo y extracción de la actividad invertasa de la
levadura de cerveza en polvo Saccharomyces cerevisiae. En el ensayo la cantidad de azucares
reductores determinan la velocidad de la reacción producida por unidad de tiempo, los
azucares reductores son glucosa y fructosa a partir de la lisis de glucosa y se expresa como
actividad específica. La cantidad de azúcares reductores se determina mediante un método
colorimétricamente utilizando DNS, por otro lado, se emplea el método de Bradford para
encontrar la cantidad de proteína que existe dentro del extracto enzimático. A continuación,
se realiza una purificación parcial con precipitación de sulfato de amonio, pero es necesario
remover el exceso de sales con un desalinizado el cual se obtiene con diálisis utilizando una
membrana permeable.

Palabras clave: enzima invertasa, Saccharomyces cerevisiae, ácido 3,5 dinitrosalicílico,

desalinizado, azúcar reductor.

2. ABSTRACT

In this report, an analysis is carried out with statistical data of the enzymatic activity of the
enzyme invertase, carrying out an assay and extraction of the invertase activity of the
powdered brewer's yeast Saccharomyces cerevisiae. In the test, the amount of reducing sugars
determines the speed of the reaction produced per unit of time, the reducing sugars are
glucose and fructose from the lysis of glucose and it is expressed as specific activity. The
amount of reducing sugars is determined by a colorimetric method using DNS, on the other
hand, the Bradford method is used to find the amount of protein that exists within the enzyme
extract. Next, a partial purification is carried out with precipitation of ammonium sulfate, but
it is necessary to remove the excess of salts with a desalinated product, which is obtained by
dialysis using a permeable membrane.
Keywords: invertase enzyme, Saccharomyces cerevisiae, 3,5-dinitrosalicylic acid, desalted,
reducing sugar.
3. INTRODUCCIÓN
Las enzimas que catalizan los glucósidos (hidrólisis de la sacarosa) son generalmente
denominadas invertasas (Ferreira et al., 2018). El nombre de invertina conocida más como
invertasa se alude a que los productos de la reacción son invertidos debido al cambio
rotacional que modifica sus propiedades ópticas, desde una rotación positiva a una rotación
negativa o levógira (Becerra, 2017). La especificidad de la invertasa se debe a que cataliza la
hidrolisis de los terminales no reductores de la β-d-fructofuranosílicos de los
fructofuranósidos, rompiendo el enlace β-d-fructofuranosil dando lugar a dos monosacáridos
(glucosa y fructosa) a partir de un disacárido (sacarosa) (Ferreira et al., 2018). Este tipo de
enzimas se encuentran presente normalmente en las levaduras, más común en la levadura
Saccharomyces cerevisiae, así también en diferentes especies de cómo es el caso de las
abejas, que usan la invertasa para producir miel a partir del néctar de las flores (Coluccio
Leskow, 2016).

La actividad de la invertasa del mismo modo que las demás enzimas se ven afectadas por las
condiciones en las que se trabaja y los compuestos presentes en la media (Paret González,
2019). Chirinosa, (2019) menciona que un factor clave es la temperatura debido a que se ha
comprobado que por debajo de los 25°C inactiva a la enzima mientas que por encima de los
55°C desnaturaliza a la enzima, por otro lado, López Requena & Robles López, (2019)
manifiesta que el pH juega un papel muy importante en la actividad catalítica de la enzima,
misa más que se ve afectada cuando está se encuentra por debajo de 4 y por encima de 8.

4. MATERIALES Y METODOS
3.1. Materiales, reactivos y equipos
Tabla 1.
Lista de equipos, materiales y reactivos empleados en el análisis de la actividad enzimática
de la enzima invertasa.
Equipos Materiales Reactivos
Centrifuga Plancha de calentamiento con Solución de bicarbonato de sodio 0,1
Baño María agitación M
Espectrofotómet Botellas de vidrio con tapa de Soluciones tampón de pH 4, 7 y 10
ro VIS y celda 100 mL, estériles Saccharomyces cerevisiae
de metacrilato Micropipeta de 100 a 1000 μL Solución de ácido 3,5
Refrigerador Tubos bacteriológicos con tapa dinitrosalicílico, DNS (DNS, NaOH 2
Estufa Tubos de centrífuga de 15 mL M y tartrato de sodio y potasio)
Balanza Microtubos de 2,0 mL Solución acetato de sodio 0,04 M de
Cronómetro pH 4,8
Medidor de pH Sacarosa: solución de 20 mg/mL en
Probeta de 10 mL tampón de actividad
Agua destilada
Solución de EDTA 40 mM en
tampón de actividad
Solución de D-glucosa 40 mM en
tampón de actividad
Solución de CuSO4 (4 mM) en
tampón de actividad
Solución de MgSO4 (4 mM) en
tampón de actividad
Solución de FeCl3 o FeSO4 (8 mM)
en tampón de actividad
Solución de CaCl2 (4 mM) en tampón
de actividad
Solución de NaCl (4 mM) en tampón
de actividad
Solución de ZnSO4 (4 mM) en
tampón de actividad

3.2. Preparación de soluciones

Bicarbonato de sodio
 Se calculó la cantidad de reactivo que se necesita pesar para preparar el volumen
requerido.
 Se disolvió en agua destilada.
Tampón de acetato de sodio
 Se determinó la cantidad de acetato de sodio a pesar para la preparación de 50 ml de
solución.
 Se determinó el volumen de ácido acético glacial para obtener 50 ml de solución 0.04
M.
 Se mezcló las soluciones de las dos muestras hasta que el pH final sea igual a 4,8.
Solución de sacarosa
 Se estableció la cantidad de sacarosa para preparar la solución
 Se disolvió la sacarosa en 25 ml de tampón de actividad.
Solución de ácido 3,5 dinitrosalicílico 50 ml
 Se pesó 0.5 gr de DNS en un vaso de vidrio de 250 ml.
 Se disolvió el reactivo con agitación en 20 ml de agua destilada.
 Se añadió 10 mL de NaOH 2 M; una vez disuelto el DNS la solución cambió de color
amarillo a naranja.
  Se pesó 15 gr de tartrato de sodio y potasio y se agregó lentamente a la solución
anterior.
 Si pierde solubilidad calentar ligeramente (40-50 °C).
 Se añadió un poco de agua cuidando de no sobrepasar el volumen final de la solución
(50 mL).
 Se aforó a 50 mL con agua destilada.
Preparación de la membrana de diálisis
 Se cortó un cuadrado de celofán de 30 cm de lado.
 Se sumergió en agua hirviente por 5 min.
 Se retiró la membrana del baño de agua.
 Se cambió el agua y se repitió el proceso dos veces más.
 Se realizó el tratamiento justo antes de utilizar la membrana para la diálisis de la
invertasa precipitada con sulfato de amonio.
3.3. Actividades por desarrollar (Protocolo)
3.3.1. Extracción de la invertasa
 Se disolvió con agitación moderada, 14 g de levadura en polvo en 100 mL de solución
de bicarbonato de sodio en un frasco de 100 mL con tapa.
 Se mantuvo la agitación por 1 hora y se incubó en un baño termostatizado a 35 °C por
15 h.
 Se destapó el frasco con cuidado, eliminando los gases formados.
 Se refrigeró la suspensión de levadura en un baño con hielo y se vertió en cuatro tubos
de centrifuga de 15 mL.
 Se centrifugó por 30 min a 5000 rpm.
 Se recuperó el sobrenadante
 Se dividió el sobrenadante en microtubos de 2 mL colocando 1,8 mL en cada tubo y
se volvió a centrifugar a máxima velocidad por 30 min.
 Se recuperó el sobrenadante
 Se mezcló el contenido de todos los tubos en tubos de 50 mL.
 Se determinó el volumen obtenido y almacenó la solución a 4 °C.
3.3.2. Ensayo de actividad enzimática
 Se añadió 50 μL de muestra (enzima) + 50 μL de sol. de sacarosa.
 Se incubó por 1 min a 30 °C.
 Se agregó 100 μL de reactivo DNS y se incubó a 100 °C por 5 minutos.
 Se enfrío la reacción en hielo por 10 min.
 Se agregó 800 μL de agua destilada y se midió la absorbancia en espectrofotómetro a
540 nm.
3.3.3. Precipitación de invertasa con sulfato de amonio
 Se colocó 10 ml de extracto de invertasa en un tubo de centrifuga de 15 ml.
 Se calculó la cantidad de sulfato de amonio solido que se necesita para añadir al
extracto y obtener una saturación del 60%.
  Se agregó poco a poco el sulfato de amonio y se agitó suavemente con una varilla
hasta que la sal quede disuelta totalmente.
 Una vez disuelto el sulfato de amonio, Se colocó en hielo durante 5 minutos y se
centrifugó a 10 mil g por 2 minutos.
 Se separó el sobrenadante en un tubo nuevo y se redisolvió el precipitado con dos
mililitros de solución tampón de actividad utilizando movimiento subes con una
varilla.
 Se midió la actividad enzimática considerando que M1 es el precipitado y M2 es el
sobrenadante con 60% de saturación con sulfato de amonio.
 Se agregó 100 μlde reactivo DNS.
 Se incubó a 100 °C por 5 minutos y se enfrió la reacción en hielo durante 10 minutos.
 Se agregó 800 μl de agua destilada y se midió la absorbancia en espectrofotómetro a
540 nm.
3.3.4. Desalinizado de la enzima
 Se tomó el ensayo con mayor actividad enzimática y se dializó en 100 mL de tampón
de actividad con la membrana dializada anteriormente.
 Se cambió la solución de tampón luego del transcurso de varias horas.
 Se tomó una muestra del ensayo ya dializado para disolverlo 20 veces con tampón de
actividad.
 Se determinó la actividad enzimática en diferentes intervalos de tiempo (1, 2, 3,4 5
minutos) en incubación.
 Se rotuló del 1 al 5, tubos de ensayo y se añadió 50 uL de la enzima disuelta en cada
uno.
 Se añadió 50 uL de sustrato desde el tubo 5 en intervalos de tiempo de 30 segundos.
 Se agregó 100 uL de reactivo DNS, así se detuvo la reacción en cada tubo y se
incubaron las muestras a 100 °C por 5 minutos.
 Se enfrió cada tubo en hielo por un periodo de 10 minutos.
 Se agregó 800 uL de agua destilada en cada ensayo.
 Se midió la absorbancia de los 5 tubos con un espectrofotómetro a 540 nm.
 Se tomó una muestra y se determinó la proteína presente en la enzima dializada.
3.3.5. Curva de calibración de invertasa empleando sacarosa como sustrato

- Se preparó soluciones con diferentes concentraciones de sacarosa (0 - 0.6 – 1.2 – 2.5 -

5 – 10) mg/mL
- Se determinó el volumen de tampón necesario para alcanzar 100 μL por microtubo
- Se agrego los componentes en orden (Tampón de actividad – Sustrato – Enzima
dializada)
- Se mezcló la muestra con ayuda de la pipeta (pipetear gentilmente hacia arriba y hacia
abajo 4 o 5 veces sin formar burbujas)
- Se incubó por 2 minutos a 30ºC
 - Se detuvó la reacción agregando 100 μL de DNS
- Se incubo por 5 minutos a 100ºC
- Se enfrió la reacción por 10 minutos en hielo
- Se agregó 800 μL de agua destilada
- Se midió la absorbancia a 540 nm

Tabla1
Valores para realizar la curva de saturación
[Sacarosa Volumen Volumen de Volumen de
] de sacarosa 20 tampón de
(mg/mL) enzima mg/mL (μL) actividad (μL)
(μL)
0 50 0 50
0.6 50 3 47
1.2 50 6 44
2.5 50 12.5 37.5
5 50 25 25
10 50 50 0

Determinación del contenido de proteínas

-Se asumió que la invertasa era la principal proteína en la muestra
-Se midió la absorbancia a 280 nm utilizando Nanodrop con la secuencia de la enzima de
Saccharomyces cerevisiae
-Se determino el coeficiente de extinción y concentración mediante la ley de Beer-Lambert
3.3.6. Curva de saturación de invertasa empleando sacarosa como sustrato y
EDTA como inhibidor
- Se preparó soluciones con diferentes concentraciones de sacarosa (0 - 0.6 – 1.2 – 2.5 - 5
– 10) mg/mL
- Se determinó el volumen de tampon necesario para alcanzar 100 μL por microtubo
- Se agregó los componentes en orden (Tampon de actividad – Sustrato –EDTA- Enzima
dializada)
- Se mezcló la muestra con ayuda de la micropipeta (pipetear gentilmente hacia arriba y
hacia abajo 4 o 5 veces sin formar burbujas)
- Se incubo por 2 minutos a 30ºC
- Se detuvo la reacción agregando 100 μL de DNS
- Se incubo por 5 minutos a 100ºC
- Se enfrió la reacción por 10 minutos en hielo
 - Se agregó 800 μL de agua destilada
- Se medió la absorbancia a 540 nm

3.3.7. Curva de saturación de invertasa empleando sacarosa como sustrato y D-

glucosa como inhibidor.

 Se empleó sacarosa como sustrato en presencia de 10 mM D-glucosa como inhibidor.

 Se añadió las soluciones Tampón de actividad: sustrato, D-glucosa, Enzima dializada
(dilución 1:10) respectivamente.
 Se mezcló el contenido del tubo mediante una micropipeta pipeteando la solución de
arriba hacia abajo de 4 a 5 veces sin crear burbujas.
 Se incubó la reacción por un tiempo de 2 min a 30 °C.
 Se agregó 100 μL de solución DNS para detener la reacción.
 Se incubó a 100 °C durante 5 minutos y se refrigeró la reacción en hielo por 10 minutos.
 Se añadió 800 μL de agua destilada.
 Se midió la absorbancia a 540 nm mediante un espectrofotómetro.

3.3.8. Determinación de la actividad de invertasa a diferentes temperaturas.

- Se añadió la solución de 50 μL de sustrato (sacarosa 20 mg/mL).

- Seguidamente la solución de tampón de reacción en un tubo adecuado.
- Se incubó a diferentes temperaturas 10, 20, 30, 40 y 50 °C por 5 min.
- Posteriormente, se agregó la enzima a la reacción.
- Se mezcló cuidadosamente mediante una micropipeta.
- Luego se incubo por 2 min a las temperaturas indicadas.
- Se detuvo la reacción con la adicción de 100 μL de solución DNS.
- Se incubo a 100 °C por 5 min.
- Consecutivamente, se enfrió la reacción mediante hielo por 10 min.
- Se agregó 800 μL de agua destilada.
- Se midió la absorbancia en espectrofotómetro a 540 nm.
- Se construyo una gráfica Vo (mg glucosa/min) vs T (°C).
- Se determino la temperatura optima y velocidad relativa para la reacción catalizada por
la invertasa empleando sacarosa como sustrato.

3.3.9. Determinación de la estabilidad térmica de invertasa.

 Se incubo 50 μL de enzima dializada (dilución 1:20) a 10, 20, 30, 40 y 50 °C por 20
min.
 Se añadió 50 μL de sustrato (sacarosa 20 mg/mL) y se incubo la reacción a 30 °C por 2
minutos.
 Se detuvo la reacción mediante la adición de 100 μL de solución DNS.
 Se incubo a 100 °C por 5 min y enfrío la reacción en hielo por 10 min.
 Se agregó 800 μL de agua destilada y se midió la absorbancia en espectrofotómetro a
540 nm.

 Se estableció las temperaturas indicadas, empelando un refrigerador (10 °C).

 Se incubo a temperatura ambiente (20 °C), y de baños termostatizados (30, 40, 50 °C).
 Se construyó una gráfica Vo (mg glucosa/min) vs T (°C) incluyendo los datos de cada
experimento.
 Se determinó la temperatura máxima que tolera la enzima con respecto a la velocidad
máxima observada.

3.3.10. Determinación de la actividad de invertasa a diferente pH.

 Se realizo la siguiente reacción:

 Se añadió 47.5 µL de solución de tampón (85 mM)
 Se adiciono 50 µL de la solución de sacarosa a 20 mg/ml y
 Se añadió 2.5 µL de enzima dializada.
 Se empleo el tampón de acetado de sodio a un pH de 3.8,4.8,5.8,6.8 y 7.8.
 Posteriormente, se agregó todos los componentes al tubo de ensayo.
 Se mezclo con la ayuda de una micropipeta 4 o 5 veces sin formar burbujas.
 Luego se incubo la reacción a 30 ℃ por 2 minutos
 Se detuvo la reacción con 100 µL de solución de DNS.
 Nuevamente se incubo a 100 ℃ por 5 min y enfriarlo en hielo por 10 min.
 Se agrego 800 µL de agua destilada para después medir la absorbancia con un
espectrofotómetro a 540 nm.
 Se realizo una gráfica Vo (mg glucosa/min) vs pH incluyendo los datos de cada
experimento.
 Se determino el pH óptimo de la enzima con respecto a la velocidad máxima
observada.
  Se estableció la velocidad relativa para cada experimento con respecto a la velocidad
máxima observada.

3.3.11. Determinación del efecto de diferentes iones metálicos sobre la actividad

de invertasa
- Se añadió en un microtubo 22,5 μL de tampón de actividad, 50 μL de sustrato (sacarosa
20 mg/mL), 25 μL stock de ion metálico (CuSO4, MgSO4, FeCl3 o FeSO4, CaCl2, NaCl y
ZnSO4) y finalmente 2.5 μL de enzima dializada.
- Luego, se realizó un control el cual sustituyo al stock de ion metálico por tampón de
actividad
- Se incubo cada reacción a 30 ºC por 2 min.
- Se añadió 100 μL de solución DNS
- Se incubo a 100 ºC por 5 min
- Se enfrió las soluciones en hielo por 10 min
- Se agregó 800 μL de agua destilada
- Se midió la absorbancia en espectrofotómetro a 540 nm.
5. RESUTADOS

Desalinización de la enzima
Tabla 2.
Determinación de actividad enzimática de enzima dializada.
Tiempo de incubación (minutos)
Ensayos 1 min 2 min 3 min 4 min 5 min
Ensayo 1 0.084 0.085 0.092 0.086 0.097
Ensayo 2 0.085 0.104 0.096 0.098 0.095
Ensayo 3 0.095 0.095 0.101 0.082 0.092
Promedio 0.088 0.095 0.096 0.089 0.095

Tabla 3.
Absorbancia a 280 nm.
Muestras Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3 Promedio
Sobrenadant
e sin dializar 36,040 33,851 36,801 35,564
Sobrenadant
e dializado 38,141 34,920 36,168 36,410
Precipitado 14,558 25,947 19,764 20,090
Extracto 37,538 37,905 38,664 38,036
 Grafica 1.
Curva de saturación de invertasa empleando sacarosa como sustrato.

[Glucosa]/Absorbancia
0.400
f(x) = 0.0215258231999 x + 0.1843103224484
0.350
R² = 0.84987460670228
Absorbancia (280 nm)
0.300
0.250
0.200
0.150
0.100
0.050
0.000
0 2 4 6 8 10 12
[Glucosa]

Fig: Curva de calibración de glucosa

Tabla 2.
Resultados de la determinación de glucosa a diferentes concentraciones
[Sacarosa] (mg/mL) Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3 promedio
0,6 0,028 0,365 0,051 0,148
1,2 0,033 0,626 0,108 0,227
2,5 0,005 0,645 0,032 0,256
5 0,027 0,647 0,459 0,328
10 0,042 0,689 0,254 0,378

Tabla 3.
Actividad enzimática
Muestras Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3 promedio
Sobrenadant
e sin dializar 36,040 33,851 36,801 35,564
Sobrenadant
e dializado 38,141 34,920 36,168 36,410
Precipitado 14,558 25,947 19,764 20,090
Extracto 37,538 37,905 38,664 38,036

Tabla 4.
Concentración de glucosa y determinación de velocidad inicial
[Sacarosa [Glucosa] [Glucosa]
] (mg/mL) mM A (mg/ml) (uM) Vo
0,0003330
0,6 4 0,148 1,688 0,0094 0,0047
0,0006660
1,2 9 0,227 1,986 0,0110 0,0055
0,0013876
2,5 9 0,256 3,335 0,0185 0,0093
0,0027753
5 7 0,328 6,684 0,0371 0,0185
0,0055507
10 4 0,378 9,009 0,0500 0,0250

Tabla 5.
Análisis de proteína con el método de Leneweaver y Burk
Leneweaver y Burk
1/[Sacarosa] (mM-1) 1/Vo
3002,60 213,41
1501,30 181,42
720,62 108,04
360,31 53,91
180,16 39,99

Grafica 2.
Curva de saturación de sacarosa

Curva de saturación
0.0300
Velocidad inicial (uM/min)

0.0250

0.0200

0.0150

0.0100

0.0050

0.0000
0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006

[Sacarosa] mM
Grafica 3.
Análisis con em método de Lineweaver y Burk

Modelo de Lenweaver y Burk

250.00
f(x) = 0.0621323655289307 x + 47.7165294780235
200.00 R² = 0.874755027321815
1/Vo (min/uM)

150.00

100.00

50.00

0.00
0.00 1000.00 2000.00 3000.00 4000.00

1/[Sacarosa] mM-1

Determinación de la estabilidad térmica de invertasa

Tabla 6.
Datos de absorbancia a diferentes tempeturas de la enzima invertasa.
Grafica 4 .
Relación de las absorbancias
frente a las temperaturas de
incubación.

Con la ecuación de la curva

patrón del ensayo se obtuvo
Temperatura Ensayo Ensayo que la concentración de la
o
C 1 2 glucosa:
10 0,048 0,059
20 0,055 0,055
30 0,052 0,051
40 0,06 0,049 ¿
50 0,049 0,053

[ Glucosa ] =¿ ¿
0,055−0,1843
[ Glucosa ] =
0,0215
[ Glucosa ] =−6.01mM
Calculo demostrativo estabilidad térmica (Vo)
Tomando en cuenta los 2 minutos de tiempo:
 Glucosa
Vo=
Tiempo
−6.01 mM
∗1 min
2 min
Vo=
60 s
mM
Vo=−0,050
s
Tabla 7 .
Relación temperatura con velocidad inicial

Temperatura Vo
10 -0.050
20 -0.050
30 -0.0507
40 -0.0508
50 -0.0519

Cálculo de la Vmax de acuerdo con Lineweaver-Burk.

Tabla 8.

Datos de temperatura de acuerdo con Lineweaver-Burk

1/ToC 1/Vo
0.1 -20
0.2 -20
0.3 -19.72
0.4 -19.68
0.5 -19.26

Grafica 5.

Relación 1/Vo VS. 1/To de acuerdo con Lineweaver-Burk

 1/ToC
-18.8
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
-19

-19.2

-19.4
1/Vo

f(x) = 1.8 x − 20.272

-19.6 R² = 0.877383015597921

-19.8

-20

-20.2

1
Vmax=
b
1
Vmax=
20.272
mM
Vmax=0,0493 .
min

6. DISCUSIÓN
Precipitación con sulfato de amonio y desalinizado de la enzima invertasa
En la actualidad el proceso de precipitación es un método de separación en los
primeros pasos de purificación, la cual es complementada con otros pasos como
desalinización, cromatografía, etc. (Veana, 2011). La precipitación con sulfato de
amonio de realiza con la finalidad de purificar parcialmente la enzima invertasa para
después medir la cantidad de azucares reductores y medir la actividad enzimática.
La precipitación de proteínas se obtiene gracias a la adición de sales, la cual esta
inducida por la variación del pH también conocido como potencial iónico, o a su vez
por adición de solventes de diferente tipo por ejemplo orgánicos, inertes o polímeros.
Después estos precipitados se pueden recuperar con la ayuda de métodos de filtración
o centrifugación, por lavado o por resuspensión en un buffer adecuado (Angal, 1990).

Curva de calibración de invertasa empleando sacarosa como sustrato

Determinación de la estabilidad térmica de invertasa

De acuerdo al estudió de la estabilidad térmica de la enzima invertasa en sistemas
donde puede ser sometida hasta temperaturas de 50 °C, permite apreciar una
inactivación significativa de la invertasa en sistemas vítreos calentados que se
mantienen muy por debajo de la temperatura de transición vítrea, pero la enzima es
 bastante estable en sistemas de temperatura que ronda los 50 °C (Danisman et al.,
2004). Sin embargo, presencia de humedad puede desestabilizar este equilibrio ya que
puede provocar fluctuaciones en la temperatura estable, perdiendo un equilibrio de la
estabilidad (Andjelković et al., 2010).

Se puede apreciar una rápida inactivación térmica de la invertasa en procesos de

calentado en las temperaturas iniciales como lo muestran las tablas y graficas
planteadas. El sistema de humedad reducida no permite predecir sobre la base de la
transición vítrea y esto resulta particularmente contradictorio al momento de mantener
la estabilidad térmica (Akgöl et al., 2001). Las condiciones de inestabilidad térmica
darán paso al colapso de los sistemas, influyendo en la actividad de la enzima invertasa.

Grupo 3 1/Vo [S]-

1/Vo [S]
1/[S] EDTA
Tabla 9.
570,5 0,540 0,213
Promedios de absorbancias con el EDTA.
285,25 0,270 0,182
[S]
(mg/mL Promedi 136,92 0,108 0,108
) E1 E2 E3 o
0 0,00 0,02 0,01 68,46 0,068 0,054
0,0137
3 6 2 34,23 0,036 0,040
0.6 0,01 0,03 0,01
0,0210
5 6 2
1.2 0,01 0,02 0,02
0,0213 Grafica 6.
7 2 5
2.5 0,01 0,02 0,01
0,0177 Modelo de Lineweaver-Burk en presencia y
3 7 3
5 0,01 0,01 0,01 ausencia de inhibidor de la invertasa (EDTA).
0,0147
2 8 4
10 0,00 0,02 0,01
0,0117
5 0 0 Inhibición con EDTA
Tabla 10.
0.600
Obtencio de la Vo para el inhibidor EDTA. 0.500 f(x) = 0.000951029890188361 x
[S] [S]-EDTA [S]-EDTA 0.400 − 0.00386696010334486
mM A R² = 0.997476310696053
(mg/mL) (mg/ml) (uM) 0.300
0.200
0 0 0,014 0,33 1,85 f(x) = 0.000326068762116173 x
0.100 + 0.0478004791535806
0,6 0,0018 0,014 0,67 3,70 R² = 0.872682353272638
0.000
0 100 200 300 400 500 600
1,2 0,0035 0,015 1,33 7,40
1/Vo [S]-EDTA
2,5 0,0073 0,018 3,33 18,50
Linear (1/Vo [S]-EDTA)
5 0,0146 0,021 5,33 29,60 1/Vo [S]
Linear (1/Vo [S])
10 0,0292 0,028 10,00 55,51
Tabla 12.

Tabla 11. Valores obtenidos de las constantes por el

método de Lineweaver-Burk (EDTA).
1/(So) vs 1/(Vo) con inhibidor EDTA y sin
inhibidor Parámetros Con
 Inhibidor que EDTA causa variaciones en Km y
Vmax (Price & Stevens, 1999). La
Vmax 256,41
(mg/min)
constante Km indica la afinidad de la
enzima respecto al sustrato. En esta caso,
Km (uM ) 0,2564 el valor Km es bajo y el valor Kcat es alto,
Kcat (s-1) 427,35 por lo tanto, la enzima difícilmente puede
realizar su actividad en varios sustratos
(Kinetics, 2009).
Tabla 13.
Valores obtenidos para el inhibidor (EDTA). Grupo 4
Parámetros EDTA Curva de saturación de invertasa
U (mM/min) 15,38 empleando sacarosa como sustrato y D-
glucosa como inhibidor.
SA (uM/mg 3576,74
proteína) Metodología
Ki (mM) 7,65  Se empleó sacarosa como
 sustrato en presencia de 10 mM D-glucosa
como inhibidor.
Discusión  Se añadió las soluciones Tampón de
Numerosos agentes químicos pueden actividad: sustrato, D-glucosa, Enzima
afectar a la actividad de los enzimas, estos dializada (dilución 1:10) respectivamente.
se los puede distinguir generalmente entre  Se mezcló el contenido del tubo mediante
activadores e inhibidores, sin embargo esta una micropipeta pipeteando la solución de
clasificación no siempre es acertada ya que arriba hacia abajo de 4 a 5 veces sin crear
diversos efectores, como los iones burbujas.
metalicos, suelen comportarse como  Se incubó la reacción por un tiempo de 2
activadores o inhibidores según sea las min a 30 °C.
condiciones del ensayo (Stein, 2011). Si  Se agregó 100 μL de solución DNS para
bien las moléculas activadoras favorecen a detener la reacción.
la actividad enzimática, al contrario de los  Se incubó a 100 °C durante 5 minutos y se
inhibidores. Según (Inga et al., 2011) el refrigeró la reacción en hielo por 10
EDTA es utilizado como un potencial minutos.
inhibidor debido a que actua como  Se añadió 800 μL de agua destilada.
quelante ionico atrapando todos los  Se midió la absorbancia a 540 nm
cationes divalentes que se enuentran en el mediante un espectrofotómetro.
medio, dejando a la enzima sin su Resultados
activador. Por tal motivo, al emplear Tabla 1
EDTA 10 mM se obtuvo un Resultados obtenidos de los 3 ensayos
comportamiento inhibitorio (Tabla 12 y diferentes.
13) en donde la enzima al encontrarse con
[Sacarosa] Ensay Ensay Ensay Promedi
el EDTA requiere de ciertos iones para (mg/mL) o1 o2 o3 o
potencializar su actividad enzimática. Los 0 0,016 0,055 0,062 0,044
parámetros que fueron calculados 0,6 0,056 0,049 0,054 0,053
mostraron una inhibición mixta (Fig.6), ya 1,2 0,055 0,058 0,051 0,055
2,5 0,056 0,054 0,057 0,056 Gráfica de Lenweaver & Burk con
5 0,059 0,056 0,060 0,058 inhibidor y sin inhibidor.
10 0,060 0,061 0,063 0,061
Nota: Esta tabla muestra los resultados de la [Sacarosa Abs [Glucosa]
Gráfica de Lenweaver & Burk[Glucosa Vo
media de los 3 ensayos a diferentes 300.000
] (mM) promedio (mg/mL) ] (uM)
concentraciones y medida a 540 nm. 0
250.000 0,0443 0,032 0,1750 0,0875
0,002 f(x) = 0.45483630865317
0,0530 x −
0,00115.5394262667072
0,0077 0,0039
200.000
R² = 0.96405482683172
0,004 0,0547 0,004 0,0245 0,0122

1/[Vo]
150.000
0,007 0,0557 0,008 0,0438 0,0219
100.000
0,015 0,0583 0,017 0,0952 0,0476
50.000
0,029 0,0613 0,0276 0,1532 0,0766
Tabla 2 0.000
f(x)0.000 200.000
= 0.000327009010932807 x +400.000 600.000
0.0477165294780237
R² = 0.874755027321812
Datos iniciales para la enzima invertasa 1/[So]
al emplear sacarosa como sustrato en
presencia de 10 mM D-glucosa como inhibidor.
Nota: Esta tabla muestra las concentraciones iniciales
de sacarosa (mM) y las concentraciones de 1/ 1/Vo (sin 1/Vo (con
[Glucosa]obtenidas a partir de la absorbancia promedio [Sacarosa] inhibidor) D glucosa)
medida a 540 nm. 570,500 0,213 258,974
Tabla 3 285,250 0,181 81,7813
136,920 0,108 45,7013
Datos obtenidos de la lineación Lineweaver 68,460 0,054 20,9979
Burk sin inhibidor y con inhibidor. 34,230 0,040 13,0575
Nota: Esta tabla muestra los valores inversos a la Nota: La representación gráfica de Lineweaver
concentración y velocidad del inhibidor. & Burk, se ejecuta graficando 1/v contra 1/[S],
permite localizar las cuantificaciones Km y
Figura 1 Vmax, el punto de corte con al eje de las
Curva de Saturación en función de la ordenadas es el equivalente a la inversa de
concentración de la Sacarosa. Vmax y el corte con el eje de las abscisas es
igual a -1/Km.
Curva de saturación sacarosa
0.1000 Cálculo demostrativo Vmax (Lineweaver
0.0800 Burk)
Vo D-Glucosa

f(x) = 2.62866741813551 x + 0.00279307399945979

0.0600
R² = 0.982082842154178
0.0400 y = 0,0003x + 0,0477
0.0200 km
∗1
0.0000 1 1 Vmax
0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 = +1
Vo Vmax=
Vmax So
[Sacarosa] (mM) b

Nota: Esta figura muestra una curva de 1

Vmax=
saturación de una reacción enzimática, donde 0,0477
se representa la relación entre la concentración
del sustrato en función de la velocidad de Vmax=¿20,96436059
reacción. Cuando la concentración de sustrato
 Cálculo demostrativo Km (Lineweaver Burk)
aumenta, disminuye la concentración de
enzima, que se convierte en la forma con
sustrato unido (ES). Km=Vmax∗m
Figura 2 Km=20,96436059∗0,0003
 Km=¿0,006289308 encuentra con la presencia del inhibidor y
disminuye la velocidad de catálisis al reducir
 Cálculo demostrativo Kcat (Lineweaver Burk) la proporción de la enzima incorporada a un
sustrato. La combinación gráfica como se
Vmax detalló en la figura 2 sin inhibidor y con
K cat = inhibidor permitió analizar la reacción para
[ E]
que logre alcanzar la 𝑉𝑚𝑎𝑥 de la enzima sin
20,96436059 inhibidor, para lograr esta condición se debe
K cat =
0,00012 poseer una mayor concentración de sustrato
para alcanzarla (Suarez et al., 1978).
K cat =¿ 1798,84586 La obtención de Km proporcionó valores
menores para enzima sin inhibidor como se
 Calculo demostrativo U (Lineweaver Burk)
detalló en la tabla 4, por lo cual los valores
menores de Km significaron que hay una
μ moles de Soluto
U= mayor afinidad de la enzima con el sustrato.
min La obtención del Kcat es el número de
μ moles P /L −6 moléculas de sustrato convertidas en producto
U =20,964 ∗100∗10 L
min por molécula de enzima en función de unidad
de tiempo en condiciones de saturación de
U =¿0,002096436
sustrato, un valor alto representó una mayor
variación de sustrato a producto.
La linealidad de Lenweaver & BurK con el
Tabla 4 inhibidor presentó menores errores, en
Parámetros obtenidos de la linealización del consecuencia, se observó en la figura 2 una
Lineweaver- Burk regresión lineal ( R2) más cercana a 1,
mostrando dos ventajas significativas las
Parámetros Sin Inhibidor Con
cuales son: una estimación más precisa del
Inhibidor
𝑉𝑚𝑎𝑥 y una alta precisión al linealizar los
Vmax (mg*ml−1 20,96436059 0,064354206
datos. Según (Aranda et al., 2008) la
/min) determinación del Ki es un indicador de
Km (mg/ml) 0,006289308 0,029268293
potencia del inhibidor la cual es la
Kcat ( s−1 ¿ concentración necesaria para producir la mitad
U 0,002096436 de la inhibición máxima. Este Ki se determinó
por el método empleado, donde se encontró
con diferenciaciones en valores obtenidos en
Nota: En esta tabla se muestra los resultados que se las curvas de inhibición competitiva a distintas
obtuvo mediante la linealidad Lineweaver- Burk sin concentraciones de sustrato. En la tabla 4 se ve
inhibidor y con inhibidor. claramente que el Ki que presenta mayor es
Discusión con el método de Lineweaver-Burk obteniendo
un 0,002132 mg/ml indicando una unión
La curva de saturación en la figura 1 permitió estrecha entre el inhibidor a una enzima, sin
adquirir el Km y el 𝑉𝑚𝑎𝑥, en la figura 2 se embargo, según (Mamani, 2018) cuando el Ki
afirmó que es una inhibición competitiva, presenta un valor grande la una unión entre la
debido a que aumenta el km porque se enzima y el inhibidor es débil.

Grupo5
Metodología
 Determinación de la actividad de invertasa a diferentes temperaturas.

- Se añadió la solución de 50 μL de sustrato (sacarosa 20 mg/mL).

- Seguidamente la solución de tampón de reacción en un tubo adecuado.
- Se incubó a diferentes temperaturas 10, 20, 30, 40 y 50 °C por 5 min.
- Posteriormente, se agregó la enzima a la reacción.
- Se mezcló cuidadosamente mediante una micropipeta.
- Luego se incubo por 2 min a las temperaturas indicadas.
- Se detuvo la reacción con la adicción de 100 μL de solución DNS.
- Se incubo a 100 °C por 5 min.
- Consecutivamente, se enfrió la reacción mediante hielo por 10 min.
- Se agregó 800 μL de agua destilada.
- Se midió la absorbancia en espectrofotómetro a 540 nm.
- Se construyo una gráfica Vo (mg glucosa/min) vs T (°C).
- Se determino la temperatura optima y velocidad relativa para la reacción catalizada por la
invertasa empleando sacarosa como sustrato.

Resultados

Tabla 14.

Resultados obtenidos de los 3 ensayos diferentes.

Temperatura
(ºC) Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3 promedio
10 0,150 0,420 0,270 0,280
20 0,072 0,340 0,470 0,294
30 0,310 0,475 0,395 0,393
40 0,435 0,378 0,421 0,411
50 0,441 0,426 0,395 0,421
Nota: Esta tabla muestra los resultados de la media de los 3 ensayos a diferentes concentraciones y
medida a 540 nm.

Tabla 15.
Datos obtenidos de la velocidad inicial a partir de diferentes temperaturas.

Temperatur
a Absorbancia [Glucosa] (mg/ml) Glucosa [mM] Vo=[Glucosa]/2min
10 0,2800 4,4512 0,024707269 0,012353635
20 0,2940 5,1023 0,028321708 0,014160854
30 0,3933 9,7225 0,05396701 0,026983505
40 0,4113 10,5597 0,058614145 0,029307073
50 0,4207 10,9938 0,061023771 0,030511885
Nota: Se determinó los valores del sustrato glucosa para encontrar los valores de la velocidad inicial.
Tabla 16
Resultados de los valores de la velocidad relativa

Temperatur
a (ºC) Vo [mM glucosa/min] Vrelativa (%)
10 0,012353635 40,48794246
20 0,014160854 46,41094345
30 0,026983505 88,43604569
40 0,029307073 96,05133268
50 0,030511885 100
Nota: Mediante los valores de la velocidad inicial se determinó los resultados de la velocidad relativa.

Figura
Efecto de la temperatura en la actividad de la invertasa.

Nota: Esta figura muestra una gráfica Vo (mg glucosa/min) vs T (°C) para determinar la
temperatura óptima para la reacción catalizada por la invertasa empleando sacarosa como sustrato
y la velocidad relativa para cada experimento con respecto a la velocidad máxima observada.

 Cálculos demostrativos de la concentración de glucosa

¿
[ Glucosa ] =¿ ¿
0,2800−0,1843
[ Glucosa ] =
0,0215
[ Glucosa ] =4,4512 mM
 Calculo demostrativo de la actividad enzimática (Vo)
 Tomando en cuenta los 2 minutos de tiempo que precede:
Glucosa
Vo=
Tiempo
0,024707269 mM
∗1 min
2 min
Vo=
60 s
mM
Vo=0,012353635
s
Posteriormente, teniendo en cuenta que el valor de Vmax es de mM / min se procede a calcular el
porcentaje velocidad relativa.

(Vo )
Vrelativa ( % ) = ∗100
( Vmax )
0,012353635 ( mM /min )
Vrelativa ( % ) = ∗100
( 0 0,030511885 mM /min )
Vrelativa ( % ) =40,48 %

Discusión

Estudio del efecto que tiene la temperatura sobre la actividad de la invertasa se realizó
mediante tres ensayos de pruebas, el cual se obtuvo que la temperatura óptima para la
reacción catalizada por la invertasa empleando sacarosa como sustrato es de 50°C como se
muestra en la tabla ..debido a que permite su máxima actividad de la invertasa, sin embargo, a
temperaturas mayores a la óptima causa perdida de la actividad enzimática, como menciana
el autor Córdoba & Valle, (2019), a temperaturas mayores de la óptima puede ocasionar la
disminución de su actividad enzimática, debido a que, la enzima sufre desnaturaliza miento,
por ende, tiende a inactivarse. De igual forma, se determinó la velocidad máxima a una
temperatura de 40 °C como se muestra en la figura .. luego tiende a disminuir su velocidad.

Grupo7
Determinación de la actividad de invertasa a diferente pH.
Resultados
Tabla 16.
Datos obtenidos en el laboratorio.
pH Ensayo Ensay Ensayo Promedio
1 (Abs) o2 3 (Abs)
(Abs) (Abs)
3,8 0,001 0,025 0,016 0,1900
4,8 0,001 0,029 0,045 0,2433
 5,8 0,002 0,050 0,095 0,4767
6,8 0,036 0,043 0,025 0,3467
7,8 0,018 0,028 0,023 0,2300
Elaboración propia
Tabla 17.
Resultados obtenidos de los diferentes cálculos actividad de invertasa a diferente pH.
pH Abs Glu mM Vo mM/s V
relativa
(%)
3,8 0,1900 0,26511628 0,0022093 19,30
4,8 0,0228811 1,67
0,2433 2,74573643 4
5,8 0,1133204 8,28
0,4767 13,5984496 1
6,8 0,0629328 4,60
0,3467 7,55193798 2
7,8 0,0177131 1,29
0,2300 2,1255814 8
Elaboración propia
Con la ecuación de la curva patrón del ensayo se obtuvo que la concentración de la
glucosa de la siguiente forma:
¿
[ Glucosa ] =¿ ¿
0,1900−0,1843
[ Glucosa ] =
0,0215
[ Glucosa ] =0,2651mM
Calculo demostrativo de la actividad enzimática (Vo)
Tomando en cuenta los 2 minutos de tiempo que precede:
Glucosa
Vo=
Tiempo
0,2651 mM
∗1 min
2 min
Vo=
60 s
mM
Vo=0,0022
s
Posteriormente, teniendo en cuenta que el valor de Vmax es de 0,684 mM / min se
procede a calcular el porcentaje velocidad relativa.
(Vo )
Vrelativa ( % ) = ∗100
( Vmax )
 ( 0,132mM /min )
Vrelativa ( % ) = ∗100
( 0,684 mM /min )
Vrelativa ( % ) =19,29 %

Discusión
La mayoría de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH u otros factores, por lo
tanto, estos cambios pueden provocar inmediatamente la desnaturalización de la proteína
(Baez et al., 2018), esto conlleva a realizar diferentes estudios, como resultado del análisis
propuesto, se visualiza en la tabla que la interacción con los diferentes niveles de pH, se
obtuvo que el pH optimo es de 4.8 demostrando que a estas condiciones la glucosa posee una
buena actividad enzimática.

La actividad enzimática a del partir el pH 6.8, según los resultados descritos se genera una
pérdida de la actividad debido a que el valor se encuentra arriba del pH optimo así alterando
las interacciones de los grupos R, lo que destruye la estructura terciaria además del sitio
activo, por lo tanto, la enzima ya no puede unirse a un sustrato de manera adecuada, esto
conlleva consecuencias como que las reacciones son imposibles volver a interactuar
(Timberlake, 2020).

GRUPO 8 Control 0,007 0,005 0,017 0,0097

MgSO
Determinación del efecto de los
4 0,009 0,001 0,008 0,0060
diferentes iones metálicos sobre la
FeCl3 0,022 0,02 0,011 0,0177
actividad de la invertasa.
CuSO4 0,018 0,021 0,04 0,0263
Tabla 18. NaCl 0,004 0,006 0,031 0,0137
Datos de absorbancia de diferentes iones CaCl2 0,005 0,006 0,001 0,0040
metálicos obtenidos por triplicado. ZnSO4 0,021 0,004 0,071 0,0320

Iones G1 G2 G3 X̄
Tabla 19. Representación de las velocidades
relativas dadas por los diferentes iones
Datos de concentración, Velocidad inicial
frente a la velocidad inicial.
y Velocidad relativa de diferentes iones.

Concentració Efecto de los iones metálicos

Vo V
n de la 24
Iones (Mm/mi relativ

Vo (Mm/min)
22
sacarosa
n) a% 20
(mM) 18
Control 45 22,5 3289 16
2800 3000 3200 3400 3600
MgSO4 46 23 3363
FeCl3 43 21,5 3143 V relativa %

CuSO4 41 20,5 2997

Cálculos demostrativos del ion CuSO4
NaCl 44 22 3216
CaCl2 47 23,3 3406 Haciendo uso de la curva de calibración
ZnSO4 39 19,7 2880 estándar se tiene la siguiente ecuación para
el ión CuSO4:

Grafica 7. |¿|0,0215 [ Glu cos a ] +0,1843

Representación de la actividad enzimática 0,0263−0,1843

[ Glu cos a ]=
0,0215
frente a diferentes iones metálicos.
mg
[ Glucosa ] =−7,35
mL
[Sacarosa] Vs Vo
24
f(x)
23= 0.4664670659 x + 1.4610778443 Transformación a Mm
R² = 0.99746869149431
22
Vo (Mm/min)

mg
21 ∗1000 ml
mL
20 −7,35
1L
19 [ Glucosa ] =
g
18
∗1000 mg
mol
180,156
17 1g
38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48
[Sacarosa] (mM)
mg
−7350
L
[ Glucosa ] =
mg
180156
mol
Grafica 8.
M∗1000 mM
[ Glucosa ] =−0,041
1M
 [ Glucosa ] =−41 mM laterales de los diferentes residuos como la
histidina, sin embargo, esta inhibición
Cálculo demostrativo para la actividad
posee carácter reversible. Retomando lo
enzimática (Vo)
mencionado los diferentes iones tuvieron
−41 mM mM diferentes valores de velocidad inicial y
Vo= =−20,5
2 min min
relativa para los cuales se usaron los
Cálculo de la Vmax de acuerdo a valores de absorbancia analizados a una
Lineweaver-Burk. longitud de onda de 540nm. En cuanto a la

1 velocidad relativa esta se obtuvo como

Vmax=
b resultado de la relación entre la velocidad
1 inicial y la velocidad máxima. Esta última
Vmax=
1,4611
variable se obtuvo tras la generación de la
mM
Vmax=0,684 . gráfica x, y su correspondiente ecuación de
min
la recta por efecto de la aplicación de la
Cálculo demostrativo para la actividad
ecuación de Lamber Beer. Lo indicado se
enzimática relativa
ve esclarecido en la parte de cálculos
Vo
V relativa ( % )= ∗100 demostrativos para el Ion CuSO4..
V max
Complementariamente, tanto al Zn como al
20,5 mM /min Cu denotan una velocidad relativa baja es
V relativa ( % )= ∗100
0,684 mM /min
decir que comparado con la velocidad
V relativa ( % )=2997 % control este ión ralentiza la velocidad de
reacción (Ohlenbusch & Vögele, 1974).
Discusión
7. CONCLUSIÓN
En este ensayo se observó cómo los
diferentes iones producían un efecto de
ralentización en cuanto a la reacción de la
8. BIBLIOGRAFÍA
invertasa con el sustrato. De hecho, se
evidencio como los iones Cu Y Zn
generaron mayor inhibición tabla (X),
enunciado que va acorde a Kozlowski &
Pallardy, (1997), quien confirma que los
metales ´pesados como Cu2+, Hg+ y el Ag +
generan un efecto inhibitorio debido a que
estos metales se unen a las cadenas
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