FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

PROGRAMA DE MEDICINA – SEGUNDO SEMESTRE

LABORATORIO DE BIOQUIMICA II
Docente: Claudia Sofia Guevara Apráez

IDENTIFICACION DE METABOLITOS EN FERMENTACION LACTICA Y

ALCOHOLICA

FUNDAMENTO TEORICO:
La glucosa por acción de la levadura de panificación (habitualmente saccharomyces cerevisiae) es
capaz, en el proceso conocido como fermentación alcohólica, de degradarse, en condiciones
anaerobias, hasta etanol. La misma glucosa por acción de lactobacillus del yogurt, se transforma en
ácido láctico en un proceso conocido como fermentación láctica. En ambos casos hay una serie de
reacciones comunes a ambos procesos, que van desde la glucosa hasta el ácido pirúvico.

El ácido pirúvico, por ser un metabolito intermediario se va a encontrar en muy baja concentración.
Igual cosa sucede con el acetaldehído, un metabolito intermediario en la fermentación alcohólica.
Para lograr detectarlos es necesario impedir que se transformen en otros compuestos, lo cual se
puede lograr bloqueando, mediante inhibidores, las enzimas que catalizan la conversión de estos
compuestos. También se pueden cambiar las condiciones fisiológicas para que la enzima funcione a
una velocidad muy por debajo de su actividad máxima o, por último, se puede usar un agente que
atrape el intermediario y que forme un compuesto que no pueda metabolizarse, como los de esta
práctica.
La enzima piruvato descarboxilasa (2-oxoácido carboxi-liasa, 4.1.1.1), que cataliza la conversión de
ácido pirúvico en acetaldehído, no es activa en soluciones ligeramente alcalinas, de manera que el
piruvato se acumula y su presencia puede demostrarse por la reacción con nitroprusiato de sodio o
2,4 dinitrofenilhidrazina.
Para “atrapar” el acetaldehído se añade a la mezcla sulfito de sodio. La presencia de acetaldehído se
puede demostrar por el color azul producido por la reacción con nitroprusiato de sodio y piperidina.
Al demostrar la presencia de acetaldehído, que es un intermediario de la fermentación alcohólica, se
puede comprobar la realización de este proceso.
En forma similar, al detectar la presencia de ácido láctico se puede comprobar que ocurrió
fermentación láctica.

MATERIALES Y REACTIVOS

Dos esferas de cristal

Baño maría
Termómetro
Embudo de vidrio
Papel filtro
Pipeta graduada de 1 o 2 ml
Levadura de panificación
Suspensión de Lactobacillus
10 ml de suspensión de levadura al 10 % en agua destilada
15 ml de glucosa al 10%
15 ml de galactosa al 10%
15 ml de fructosa al 10%
15 ml de sacarosa al 10%
15 ml de maltosa al 10%
15 ml de manosa al 10%
25 ml de ácido tricloroacetico al 10%
10 g de sulfato de amonio solido
50 ml de nitroprusiato de sodio al 5 % (recién preparado, debe prepararse el día de la practica)
20 ml de amoniaco concentrado
10 ml de solución saturada de 2,4 dinitrofenilhidrazina
20 ml de hidróxido de sodio al 10 %
20 ml de piperidina al 3 %
10 ml de éter etílico
5 g de carbonato de sodio finamente pulverizado
10 g de sulfito de sodio
25 ml de solución de yodo-yoduro: 4 g de yoduro de potasio y 2 g de yodo en 50 ml de agua
destilada
5 ml de ácido pirúvico al 2%
5 ml de ácido láctico al 2 %
5 ml de acetaldehído al 5%
5 ml de etanol al 10%
20 ml de solución sulfocromica diluida
25 ml de solución de cloruro férrico al 0,3%

PROCEDIMIENTO
Rotule 6 tubos de ensayo con números del al 6 y a cada tubo agregue las sustancias tal como se
describen en la tabla.

TUBOS
1 2 3 4 5 6
Glucosa 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml
Levadura en 5 ml ____ 5 ml ____ 5 ml ___
agua
Yogurt YOX ----- 5 ml ---- 5 ml ----- 5 ml
Tiempo en 25 min 25 min 25 min 25 min 1 hora 1 hora
baño maría a agregar 5 agregar 5 agregar agregar
40°C gotas gotas 0.5g de 0.5g de
NaOH al NaOH al sulfito de sulfito de
10% y 10% y sodio y sodio y
dejar en el dejar en el dejar en el dejar en el
baño otros baño otros baño otros baño otros
5 min 5 min 5 min 5 min
Acido ___ ___ ___ ___ 2 ml 2 ml
tricloroacétic
o
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Docente: Claudia Sofia Guevara Apráez

Una vez cumplido el tiempo en el baño maría (30 min para el caso de los tubos 1,2,3 y 4 y 1 hora
para los tubos 5 y 6) se debe filtrar a través de una gasa y con el filtrado se realizan las pruebas que
se describen a continuación.

Determinación de piruvato con nitroprusiato de sodio:

En un tubo de ensayo caliente hasta ebullición 2 ml del filtrado y agréguele 1 g de sulfato de

amonio sólido. Adicione dos gotas de solución de nitroprusiato de sodio mezcle vigorosamente y
deje deslizar por las paredes del tubo, amoniaco concentrado hasta que se formen dos capas. Si hay
piruvato se forma un anillo verde o azul en la interfase de los dos líquidos. La formación de un
anillo rosado transitorio en la interfase indica la presencia de grupos tioles y con frecuencia se
observa antes de la coloración azul o verdosa característica de la reacción con piruvato.

Determinación de piruvato con 2,4-dinitrofenilhidrazina:

A 2 ml de filtrado agregue 1 ml de solución saturada de 2,4-dinitrofenilhidrazina, mezcle
vigorosamente, coloque tres gotas de la mezcla en un tubo de ensayo, agregue 1 ml de solución de
hidróxido de sodio al 10% y diluya con agua destilada hasta 5 ml. La formación de un color rojo
indica la presencia de piruvato.

Determinación de acetaldehído
A 2 ml de filtrado agregue 2 ml de solución de nitroprusiato de sodio y 2 ml de piperidina acuosa y
agite. Si hay acetaldehído presente se observa una coloración azul.

Determinación de etanol

A 2 ml de filtrado agregue 0,2 g de carbonato sódico. Después de disolverlos se pone el tubo en un

baño maría mantenido a unos 70 °C y se van añadiendo gotas de solución de yodo-yoduro hasta que
no desaparezca el color del yodo. Llegado a este punto se dejan los tubos unos tres minutos más en
el baño de agua caliente y luego se enfrían en un baño de agua fría; se apreciará un precipitado
amarillo de yodoformo de olor característico.

Determinación de etanol mediante su oxidación con ácido sulfocromico a acetaldehído

A 1 ml del filtrado se le añaden 0,5 ml de solución sulfocromica diluida. Tras mezclar bien el
conjunto se calienta en un baño de agua hirviente; aparece un intenso color verde, percibiéndose el
olor característico del acetaldehído.

Determinación de Ácido Láctico

A 1 ml de filtrado agregue 1 ml de éter etílico y agite intensamente el conjunto; al separarse las
fases se recoge la fase etérea (parte superior) y se le añade un volumen igual de solución de cloruro
férrico. El lactato férrico que se forma confiere al conjunto un intenso color verde amarillento.

Consulta previa (preinforme)

1. Consulte las reacciones que ocurren en cada una de las pruebas realizadas.
2. ¿Para qué se usa el ácido tricloroacético?
Resultados

Registre los resultados obtenidos en la siguiente tabla:

TUBOS
PRUEBAS 1 2 3 4 5 6
Piruvato con nitroprusiato
Piruvato con fenilhidrazina
Etanol con carbonato
Determinación etanol por oxidación
Determinación de acetaldehído
Determinación de ácido láctico
Preguntas orientadoras para el análisis de resultados (informe)

1. En base en sus resultados determine si ocurrió fermentación alcohólica o fermentación

láctica.
2. En caso de no producirse los resultados esperados, ¿que pudo ocurrir en la muestra?