CÁTEDRA DE QUÍMICA BIOLÓGICA—FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES—UNSa

LABORATORIO 4:
CINÉTICA ENZIMÁTICA PARTE I: EXTRACCIÓN DE LA FRUCTOSIDASA DE LEVADURA

OBJETIVOS
– Comprender en forma práctica los conceptos y definiciones dadas en teoría.
– Extraer la enzima fructosidasa de la levadura de panadería Saccharomyces cerevisiae.
– Realizar una curva de calibración del producto de reacción de la fructosidasa (glucosa)
que será utilizada en las prácticas de cinética enzimática posteriores.

INTRODUCCIÓN

Las enzimas son proteínas con propiedades catalíticas, elaboradas por las células,
susceptibles de ser reguladas y que presentan alta especificidad por las reacciones que catalizan. En
los trabajos de Laboratorio 4, 5 y 6 estudiaremos particularmente la actividad de la enzima
fructosidasa (EC 3.2.1.26), también llamada: β-fructofuranosidase, invertasa, sacarasa, o β-D-
fructofuranosido fructohidrolasa. En el presente trabajo realizaremos la extracción de la enzima a
partir de la levadura de panadería fresca. En los trabajos 5 y 6 estudiaremos la cinética de la enzima,
obteniendo finalmente los parámetros cinéticos km y Vmax.
La fructosidasa, se denomina así, porque ataca azúcares que contienen fructosa con
configuración  y el anillo 2, 5 oxigenado (Figura 1). El proceso se llama inversión debido a que el
poder de rotación óptica cambia del dextro al levo, por alto poder rotatorio de la fructosa. Se
encuentra solo en plantas y microorganismos. Las más altas concentraciones están en levaduras. La
cantidad de enzimas en las levaduras puede ser incrementada por incubación de las levaduras con
pequeñas cantidades de sacarosa. La enzima es inhibida por iones de metales pesados (Ag+, Cu++,
Hg++) y por anilina.

H2
O

Fructosidas
a
Glucosa Fructosa
(α-D-glucopiranosa) (β-D-fructofuranosa)

Sacarosa
(α-D-glucopiranosil-β-D-fructofuranosa)

Fig. 1: Acción de la fructosidasa: hidroliza la sacarosa en la unión de la fructosa con la glucosa. el pH

óptimo de actividad es 4,5.
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TRABAJO DE LABORATORIO
En el presente práctico iniciará con la extracción de la enzima fructosidasa a partir de levadura
fresca. Luego de extraer la enzima, realizaremos diluciones sucesivas de la misma. Estas diluciones
serán utilizadas en el laboratorio 5 para la determinación de la concentración óptima de enzima. Por
otro lado, en esta práctica de laboratorio se construirá la curva de calibración del producto de la
reacción: la glucosa. Este azúcar es un azúcar reductor debido a que tiene el grupo aldehído libre. La
reacción catalizada por la fructosidasa en la que la sacarosa es hidrolizada, da lugar a dos productos:
glucosa y fructosa, que son isómeros. Sin embargo, en medio alcalino la fructosa se isomeriza a
glucosa a través del enediol intermediario que es la forma reactiva de los azúcares reductores. Por lo
tanto, construiremos una curva de calibración de glucosa como único producto de la reacción. Esta
curva será necesaria para las determinaciones cinéticas de los laboratorios 5 y 6.
La concentración de glucosa se valorará mediante uno de los diversos métodos existentes
para la estimación de azúcares reductores. Concretamente para medir los productos de la acción
enzimática se utilizará el método de Somogyi-Nelson.

Fundamento de Somogyi-Nelson: En medio alcalino y en caliente, el reactivo cúprico (Cu++) de

Somogyi es reducido a Cu2O (cuproso: Cu+) por la acción de azúcares reductores (glucosa). El Cu2O
liberado actúa sobre el reactivo arsenomolíbdico de Nelson formando un complejo coloreado en el
que el molibdeno se reduce. El complejo se lee espectrofotométricamente a 520 nm.
Materiales
1) Instrumental de uso común:
– Balanza, centrífuga, baño termostático, baño de agua hirviendo, espectrofotómetro.
2) Elementos de uso para la extracción de la enzima:
– Mortero y pilón
– Levadura de panadería fresca 2 g
– Fosfato diamónico 0,2 g
– Tolueno 0,4 mL
– Tubo de centrífuga
– Tubo eppendorf (para guardar el extracto de enzima)
2) Reactivos para cuantificar azúcares reductores por el método de Somogyi-Nelson:
– Reactivo cúprico de Somogyi:
Solución A: SO4 Cu. 5 H2O al 10%. Pesar 20 g y llevar a 200 mL con agua destilada
Solución B: Disolver 56 g de fosfato disódico anhidro en 1400 mL de agua destilada. Añadir
80 g de tartrato de sodio y potasio. Cuando se ha disuelto totalmente agregar 200 mL de
hidróxido de sodio 1 N seguido de 240 g de sulfato de sodio anhidro. Cuando está todo
disuelto llevar a 1800 mL con agua destilada. Dejar en reposo en oscuridad 48 horas y filtrar.
Para preparar el reactivo de Somogyi se mezcla:
1 volumen Solución A + 9 volúmenes Solución B
– Reactivo de Nelson:
Disolver 50 g de molibdato de amonio en 900 mL de agua destilada; luego añadir 42 mL de
ácido sulfúrico concentrado y mezclar. Luego agregar 6 g de arseniato disódico
previamente disuelto en 50 mL de agua destilada. Incubar a 37° C durante 48 horas. Guardar
en frasco color caramelo.
– Solución patrón de glucosa (C6H12O6, PM 180) 1mM: preparar solución stock 10 mM
(10x), pesar 0,018 g de glucosa y llevar a 10 mL en agua destilada. Diluir 1/10 en agua
destilada antes de usar.
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3) Soluciones para la reacción enzimática

– Solución Buffer acetato 0,1 N pH 4,8. Medir 50 mL de AcNa 0,2 N y llevar a 100 mL con
agua destilada.
– Solución de sacarosa (C12H22O11, PM 342,3) 0,2 M: pesar 6,85 g de sacarosa pura y
llevar a 100 mL con buffer acetato 0,1 N pH 4,8. Concentración final 200 moles/mL.
Preparar en el momento de uso.
– Solución enzimática (extracto crudo)

Procedimiento
Comprende 3 etapas:
1. Extracción de la enzima: la fructosidasa se extrae por autolisis de las células de levadura en
suspensión acuosa, de donde pasa a la solución. El homogonado se centrifuga y se obtiene el
extracto crudo de enzima (EE) que se utiliza sin más purificación.
En un mortero pequeño se coloca 0,2 g de fosfato diamónico y 0,4 mL de tolueno, luego se agrega
2 g de levadura y se disgrega utilizando el pilón. Se deja en reposo 10 min, y luego mientras se
disgrega la pasta con el pilón, se le agrega en pequeñas porciones 9 mL de agua destilada a
35 °C procurando deshacer y suspender bien todo el material. Se deja en reposo 10 min con
agitación ocasional. Se trasvasa a un tubo de centrífuga y se centrifuga a 3.500 rpm durante 10'.
Se recupera cuidadosamente el sobrenadante límpido en un tubo eppendorf, se rotula y se lo
guarda en freezer a -20°C para usar en el próximo trabajo práctico.
2. Preparación de diluciones sucesivas del extracto de enzima
Coloque 0,1 mL del extracto crudo de enzima y agregue 1,9 mL de solución amortiguadora
acetato 0,1 N pH 4,8. De esta manera se obtiene la dilución 1/20. A partir de esta dilución se
hacen el resto de las diluciones según el esquema de la Figura 2.

Fig. 2. Esquema de diluciones sucesivas del extracto de enzima (EE)

Completar la tabla:
Enzim Volumen alícuota Volumen Volumen total Factor de Dilución final
a (Va) mL buffer mL (Vt) mL dilución (Vt/Va)
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EE 0,1 1,9 2 20 1/20

1/20 0,5 1,5 2 4 1/80
1/80 0,5 0,5
1/160 0,5 0,5
1/320 0,5 0,5
1/640 0,5 0,5

3. Construcción de la curva de calibración de glucosa: La glucosa (reductora) es el producto formado

por acción de la enzima fructosidasa sobre la sacarosa (no reductora), se cuantifica por el método
de azúcares reductores de Somogyi-Nelson.
Preparar una serie de tubos como se indica en la tabla:

Tubos Gluc. 1mM Glucosa H2O dest Rvo. Rvo. H2O %T Abs
(mL) moles mL Somogyi Nelson dest 520nm
Bco. - 1.0 1 mL Hervir Enfriar 1 mL 2 mL
1 0.1 0.9  10 min en  
2 0.2 0.8 Baño baño
3 0.3 0.7 María de
4 0.4 0.6 hielo
5 0.5 0.5

Recomendaciones: para que el reactivo cúprico (Cu++) de Somogyi sea reducido a óxido cuproso
(OCu2) por la acción de la glucosa, los tubos se incuban en baño María hirviendo por 10 min,
luego se los saca del baño hirviente y se los enfrían en un baño de agua helada. Cuando los tubos
están fríos recién se agrega el reactivo de Nelson y se mezcla bien para que todo el óxido cuproso
liberado (suspensión color rojiza) actúe sobre el reactivo arsenomolíbdico de Nelson formando
un complejo coloreado en el que el molibdeno se reduce. Luego de la reacción se agrega 2 mL
de agua a cada tubo, se mezcla bien y se lee en espectrofotómetro a 520 nm.
Con los datos obtenidos se grafica Abs (absorbancia) en función de moles (micromoles) de
glucosa.

BIBLIOGRAFÍA

– BERG J.M., TYMOCZKO J.L., STRYER L. 2008. Bioquímica. Sexta edición. Editorial Reverté
– TORRES, H., H. CARMINATTI y C. CARDINI. 1983. Bioquímica Gral. Ed. El Ateneo. Buenos
Aires.
– RAWN. 1991. Bioquímica - Problemas - Ed. Interamericana McGraw-Hill. España.
– SUMMER, J. y SOMMERS, F. G. 1943. Chemistry and Methods of Enzymes. Academic Press,
Inc., Publishers, New York, N.Y.