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Anexo 3 d.

Determinacin del contenido de vitamina C



Se utiliz el mtodo espectrofotomtrico reportado por Al-Ani et al. (2007) para la
determinacin del contenido de vitamina C.

1. Fundamento

Este mtodo se basa en la cuantificacin espectrofotomtrica del complejo
coloreado formado por la reaccin entre los productos de oxidacin del cido ascrbico y el
reactivo 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNP). El mtodo colorimtrico de 2,4-
dinitrofenilhidrazina ampliamente utilizado para la determinacin del nivel de cido
ascrbico en los fluidos biolgicos se adapt a la estimacin total contenido de vitamina C
en las frutas.

El procedimiento depende del principio de la oxidacin de cido L-ascrbico en
cido dehidroascrbico y 2,3-dicetogulnico, seguido de la reaccin con 2,4-
dinitrofenilhidrazina. Despus del tratamiento con cido sulfrico, un producto de color
rojo parduzco se forma cuya absorbancia se mide a 520 nm.La absorbancia del color
formado es proporcional a la cantidad de cido ascrbico (ms cido dehidroascrbico)
presentes en la solucin antes de la oxidacin.

2. Reactivos

- cido metafsforico al 6%
- cido sulfrico 4,5mol/L
- cido sulfrico 12 mol/L
- 2,4-dinitrofenilhidrazina al 2.2%
- Tiourea al 5%
- Solucin sulfato de cobre al 1%
- cido ascrbico



2.1. Solucin de cido metafosfrico al 6%

Se disolvi 60g de cido metafosfrico en 400 mL de agua destilada. Se mezclo
bien y se transfiri en un fiola de 1L y se enraz con agua destilada hasta la lnea de aforo.
Se almacen a 4C por un tiempo no mayor a una semana.

2.2. Solucin de 2,4 dinitrofenilhidrazina al 2.2%

Se disolvi 4,84g de 2,4 dinitrofenilhidrazina en 220 mL de una solucin de cido
sulfrico 4,5 mol/L. Se mezclo bien, se friltro y se transfiri a un fraco. Se almacen a 4C
por un tiempo no mayor a una semana.

2.3. Solucin de tiourea al 5%

Se disolvi 5g de tiourea en 20 mL de agua destilada. Se mezclo bien y se transfiri
en un fiola de 100mL y se enraz con agua destilada hasta la lnea de aforo. Se almacen a
4C por un tiempo no mayor a un mes.

2.4. Solucin de sulfato de cobre al 1%

Se disolvi 1,56g de sulfato de cobre (CuSO
4
5H
2
O) en 20 mL de agua destilada. Se
mezclo bien y se transfiri en un fiola de 100mL y se enraz con agua destilada hasta la
lnea de aforo. Se almacen a 4C por un tiempo no mayor a un mes.

2.5. Reactivo dinitrofenilhidrazina-tiourea-sulfato de cobre (DTC)

Se combin 10 mL de solucin tiourea al 5%, 10 mL de solucin sulfato de cobre al
1% y 200 Ml del reactivo 2,4-dinitrofenilhidrazina al 2,2% Se mezcl bien y se almaceno
en una botella ambar cerrada a 4C por un tiempo no mayor a una semana.




2.6. Soluciones de trabajo o estndares

Se empleo el cido ascrbico como solucin de trabajo, ya que es de uso comn
como estndar en las curvas de determinacin de vitamina C.

2.6.1. Solucin madre de cido scorbico

Se prepar una solucin madre de cido ascrbico, para la cual se pes 10 mg de
cido scorbico y se disolvi en 100 mL de cido metafosfrico al 6% en una fiola.

2.6.2. Estndares o soluciones de trabajo de cido ascrbico

A partir de la solucin madre de cido ascrbico de 0,1 mg/mL, se prepararon
soluciones de trabajo a distintas concentraciones. Se graficaron los valores de
concentracin de cido ascrbico y sus absorbancias, los cuales fueron analizados por
medio de una regresin lineal.


y = 3.9222x - 0.0085
R = 0.9969
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
c
i
d
o

a
s
c

r
b
i
c
o

(
m
g
/
1
0
0
m
l
)


Absorbancia a 520 nm
Curva Estandar de Determinacin de vitamina C

Figura 22: Curva estndar de cido ascrbico para la determinacin del contenido de
vitamina C


3. Preparacin de la muestra

La fruta fue lavada con agua destilada y luego se separ la pulpa de la cscara y
semilla. Se utiliz la pulpa para la preparacin de los extractos. Se peso 1 g de muestra y se
mezcl con 9 mL de solucin de cido metafosforico al 6% y se llev a centrifugar a 6000
RPM por espacio de 10 minutos a 4C. Luego se procedi a filtar con paper Whatman N1,
seguido de otra filtracin usando papel filtro 0.45 m ambas al vaco.

4. Procedimiento

Una vez obtenida la solucin de trabajo (muestra), con una micropipeta se tom
1200 L de la muestra (sobrenadante claro) y se diluyo con 400 L de reactivo DTC en
un tubo de ensayo. Este procedimiento se realiz por triplicado. Al mismo tiempo se
prepar un blanco con 1200 L de solucin de cido metafsforico al 6% en lugar de la
muestra y se procedi de igual manera que con la muestra.

Se agit en el vortex y se llev a incubar en bao mara a 37 C por un tiepo de 3
horas.

Transcurrido el tiempo se procedo a enfriar por un espacio de 10 minutos, haciendo
uso de hielo. Luego se aadi lentamente 2 mL de solucin fra de cido sulfrico 12mol/L
a cada uno de los tubos de ensayo, y se procedi agitar la mezcla en el vortex.

Se llev a cero el espectrofotmetro haciendo uso del blanco, para ello se transfiri
la solucin a una cubeta de vidrio limpia, sacudindose cuidadosamente para eliminar las
burbujas que podran estar presentes y se realiz la lectura a 520 nm.




Se elabor una curva patrn utilizando cido ascrbico como compuesto de
referencia. Los resultados se expresaron en mg equivalente de cido ascrbico / 100g de
muestra.



a + bX: Proviene de la curva estndar.Donde X: Abs
520nm.
La ecuacin que se obtuvo
a partir de la grfica de la curva estndar es la siguiente:y = 3,9222x + 0,0085.

V: (Volumen de solvente en mL + Volumen de muestra en mL) / (Volumen de
muestra en mL). Se asume que la muestra tiene densidad igual a 1, es decir 1g=1mL.






mg de cido ascrbico/100 mL muestra = (a + bX) *V