PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR

TIAMINA (VITAMINA B1)

EN HARINA DE TRIGO
Mtodo FluoromtricoHPLC

ALUMNO : DIAZ RUIZ

JHONNAR

TERMINOLOGA

Tiamina:
parte

Se encuentra en forma sinttica frecuentemente como Tiamina Clorhidrato o mononitrato, aunque existen ms sales de Tiamina. pertenece al grupo de las vitaminas solubles y se denomina Vitamina B1. Forma
del
grupo
de
vitaminas
del
complejo
B.

MTODOS
La Association of Official Analytical Chemist (AOAC, 1990)
recomienda la determinacin de vitaminas del complejo B
mediante mtodos microbiolgicos, espectrofotomtricos y
fluoromtricos. La cromatografa lquida de alta resolucin
(HPLC) ha sido la principal tcnica de anlisis de las mezclas de
vitaminas (Kwok, 1981, Gennaro, 1991) y ms recientemente se
ha utilizado la electroforesis capilar para separar dichas mezclas
(Fujiwara, 1988; Buskov, Mller, Sorensen, et al, 1998).
Los detectores flluoromtricos y espectrofotomtricos acoplados
a HPLC han sido empleados para el anlisis de las vitaminas B1,
B2, B6, B12 y la nicotinamida, tanto en preparaciones
farmacuticas como en fuentes naturales.

MATERIALES, EQUIPOS y REACTIVOS

Materiales

Columna HPLC C18 5 m * 125 mm * 4,6 mm.

Precolumna C18 (5 m) 4*4

Matraz aforado mbar de 1000 mL

Matraz aforado mbar de 500 Ml

Matraz aforado mbar de 100 mL

Matraz aforado mbar de 50 mL
Matraces Erlenmeyer de 250 y 125 color mbar y cuello esmerilado con tapa
Pipetas de 5 y 10 mL
Probetas
Embudos
Esptula
Jeringas desechables de 5 o 10 mL
Papel filtro Whatman N 2
Dispositivos de filtracin sobre membrana Millipore
Membranas Millipore de 0,22 micras de 13 mm
Membranas Millipore de 0,22 micras de 47 mm
Navecillas

MATERIALES, EQUIPOS y REACTIVOS

Equipos

Cromatgrafo Liquido de Alta Resolucin (HPLC) con detector de fluorescencia

Balanza analtica sensibilidad 0,01 g

Balanza analtica sensibilidad 0,001 g

Bao termorregulado con agitacin magntica y rango de temperatura de 40 a 50 C

Bao termorregulado con rango de temperatura de 80 a 90 C

PHmetro

Estufa

Placa calefactora con agitacin magntica

Bomba de vaco

Sonicador

Purificador de Agua Milli-Q

Campana de Extraccin Qumica

MATERIALES, EQUIPOS y REACTIVOS

Reactivos

cido clorhdrico fumante 37 % p.a.

cido clorhdrico 1 N. En un matraz aforado de 1000 mL que contenga aproximadamente 500 mL

de agua destilada, aadir con cuidado 82 ml de HCL al 37%, enrasar con agua destilada.

Hidrogenofosfato de di-Potasio trihidratado p.a. (K2HPO4 3 H2O) p.a

Solucin de Hidrogenofosfato de di-potasio, solucin 10 mM pH 7,2. En un vaso de 1000 mL pesar

exactamente 2,28 g de K2HPO4 3 H2O.y disolver en aproximadamente 800 mL de agua destilada. Ajustar el
pH a 7,2 con HCL 1N.Trasvasar a un matrazaforado de 1000 mL y enrasar con agua destilada. Desgasificar
bajo presin reducida y filtrar a travs de. Membranas Millipore 0,22 micras x 47 mm.

N,N-Dimetilformamida grado ACS.

NaOH 15%

Papana soluble p.a

Sodio Acetato trihidratado p.a.

Solucin de acetato de sodio 2,5 M: Pesar 340 mg de g de acetato de sodio trihidratado y llevar a
un matraz aforado de 1000 mL con agua destilada y enrasar.

Fase mvil: Mezclar N,N-dimetilformamida + Hidrogenofosfato de Di-potasio, 10 mM pH 7,2. (30:70).

Takadiastasa p.a

Tiamina clorhidrato estndar, almacenar en desecador con deshidratante adecuado.

Ferricianuro de potasio p.a.

Solucin de ferricianuro de potasio al 1%. Pesar 0,1 g de ferricianuro de potasio y llevar a 10 mL con agua
destilada o desionizada.

Solucin oxidante: Tomar 4 mL de la solucin de ferricianuro de potasio al 1% en un matraz de 100 mL y

enrasar con solucin de NaOH al 15%.

cido Ortofosfrico

Solucin Estndar de Tiamina:

Solucin stock de 1 mg/mL: Pesar exactamente 63,6 mg de Tiamina Clorhidrato,

los cuales equivalen a 50 mg de Tiamina en un matraz de 50 mL color mbar,
disolver en agua desionizada adicionando 5 mL de HCL 1N y enrasar con agua
desionizada. Guardar en frasco oscuro a una temperatura menor de 10 C (preparar
la solucin cada 6 meses o cuando se requiera).

Solucin intermedia de 100 g/mL: Diluir 5 mL de la solucin stock a 50 mL con

agua desionizada. Guardar en frasco oscuro a una temperatura menor de 10 C.

Solucin de 10 g/mL: Diluir 5 mL de la solucin intermedia de 100 g/mL en un

matraz de 50 mL y enrasar con agua desionizada.

Solucin de 1 g/mL: Diluir 5 mL de la solucin de 10 g/mL en un matraz de 50

mL y enrasar con agua desionizada.

Curva de trabajo de 0,02 0,05 0,1 y 0,2 g/mL:

En matraces aforados de 10 mL de color mbar tomar alcuotas de 0,2 - 0,5 1,0 y 2,0
mL
respectivamente de la solucin de 1
g/mL (y proceder a la oxidacin agregando
2,0

preparacin de la muestra

La vitamina B1 no es sensible a la luz; en cambio el tiocromo que es el producto de la

oxidacin si es fotosensible, por lo cual se debe utilizar material mbar o color marrn durante
la etapa de oxidacin.

Homogeneizar la muestra en forma manual, agitando el envase o bolsa sin abrirla, pesar entre
4,0 a 5,0 g de harina en un matraz Erlenmeyer mbar con tapa de 250 mL, anotar
exactamente lo pesado.

Adicionar 0,5 g de Taka-Diastasa, 0,25 g de papana y 20 mL de agua desionizada a +45-50 C.

Mezclar bien a fin de obtener una suspensin homognea.

Tapar el matraz y colocarlo durante 30 min. en un bao termorregulado con agitacin a + 4550 C. Enseguida aadir 50 mL de agua desionizada entre + 45-50 C.

Hidrlisis

Aadir 5 mL de HCL 1 N al matraz anterior, mezclar bien tapar el matraz

con papel alumnio. Calentar por 45 min. a bao mara hirviente agitando
ocasionalmente para evitar grumos.

Enfriar y aadir 5 mL de acetato de sodio 2,5 M, mezclar bien y transferir

cuantitativamente a un matraz aforado de 100 mL color mbar y enrasar
con agua destilada.

Filtrar a travs de papel filtro Whatman N 2 y membranas Millipore de 0,22

micras de 13 mm. La solucin est lista para la oxidacin.

Oxidacin

En un matraz aforado de 10 mL color mbar, adicionar una alcuota de 1mL

de filtrado anterior que contiene la tiamina.

Aadir 3 mL de solucin de ferrocianuro de potasio alcalino, agitar por 2 min

en forma constante.

Aadir 0,45 mL de cido ortofosfrico concentrado, mezclar, enfriar y

enrasar con agua desionizada.

La solucin est lista para traspasar a vial mbar e inyectar en HPLC.

Determinacin cromatogrfica de
Tiamina
Curva de calibracin de las soluciones estndares

Inyectar en triplicado 20 L de cada una de las soluciones estndares de

acuerdo al punto 6.5.

Tiempo de corrida: 7 minutos.

Realizar la curva de calibracin utilizando el mtodo de clculo con

estndar externo integrado en el equipo.

Condiciones Cromatogrficas de
Tiamina

Columna
: C18 o RP 18 (5 m) 125 x 4,6 mm y Pre-Columna RP
18 (5 m) 4-4

Fase mvil
: Mezcla N,N-dimetilformamida + Hidrogenofosfato de
Di-potasio, 10 mM pH 7,2. (30:70)

Inyeccin

Flujo o caudal

: 0,8 mL / min.

Detector
436 nm

: Espectrofluormetro, Excitacin: 365 nm y Emisin

: 20 L

Cuantificacin de Tiamina en
muestras

Ingresar al HPLC en mtodo Tiamina que contiene la curva de

calibracin obtenida de concentracin (C) en g/mL e interpolar la
muestra para cuantificar el resultado del rea vs concentracin. Valor C
(g/mL)

Inyectar en duplicado 20 L de la solucin eluida del extracto de la

muestra de harina de trigo.

Tiempo de corrida: 7 minutos.

Clculo e informe de resultados

mg /Kg =

Donde:
C=
Concentracin en g/mL obtenidos por la interpolacin en la
curva de calibracin de la muestra.
V=

Volumen de la muestra final

M=

Masa de la muestra en gramos F =

P=

Porcentaje de Pureza del Estndar dividido por 100

Factor de dilucin

Control de Calidad
Se efectuarn controles sistemticos y peridicos para comprobar la validez de los
ensayos realizados con el mtodo analtico recogido en este procedimiento.

Nivel I: Ensayos de intercomparacin, utilizacin de materiales de referencia

certificados y patrones de referencia certificados, segn su disponibilidad.

Nivel II: Materiales de referencia sin certificacin externa o muestras fortificadas

por el analista en la validacin cuando se requiera.

Nivel III. Durante el desarrollo de la serie de trabajo si es factible se incluir:

Control de blanco al inicio de la corrida cromatogrfica.

Inyeccin de uno o ms puntos de solucin patrn conocida.

Inyeccin de material control de valor conocido (quality control), cuyo

resultado se grafica en una carta de control para su seguimiento.