UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIA

EXACTAS E INGENIERÍAS

PRÁCTICA 1. CINÉTICA ENZIMÁTICA DE LA ENZIMA INVERTASA.

OBJETIVO.
Adquirir la habilidad para determinar el valor de las constantes cinéticas
enzimáticas como la Km y la Vmax en condiciones predeterminadas.

INTRODUCCIÓN.
Las enzimas son catalizadores empleados por los seres vivos, conocer cuáles son
las leyes y las variables que afectan la velocidad de reacción, que rigen la cinética
de estos biocatalizadores es de gran importancia, pues este conocimiento
permitirá diseñar y operar los procesos enzimáticos.
Cuando una molécula de sustrato se ha transformado por la enzima en producto, a
esto se le denomina reacción enzimática, ya que los sitios reactivos de la enzima
(sitios activos) pueden catalizar una reacción química convirtiendo una molécula
en otra. Dada la compleja naturaleza de las enzimas y el fenómeno enzimático en
sí, no es de extrañar que muchos parámetros afecten la velocidad de reacción.
Entre los más importantes se cuentan: tiempo, temperatura, pH y concentración de
sustrato.

MATERIAL Y REACTIVOS.

Material:
● 5 Matraces aforados 100 mL

● 10 tubos de ensaye 5 mL

● 5 Agitadores magnéticos

● 1 pipeta automática de 100 a 1000 μL

● 1 pipeta de 5 ó 10 mL

● Hielo

Equipo:
●Baño maría

●Espectrofotómetro.
 ●Parrilla de agitación

Reactivos:
● Enzima (Invertasa)

● Soluciones de sacarosa a 10, 20, 30, 40 y 50 mM

● Reactivo DNS (ácido 3,5 dinitro salicílico)

● Curva de calibración de glucosa y fructosa a concentración de 0.1 a 2 g/L en

solución de acetato de sodio 0.1 M
● Agua destilada

PROCEDIMIENTO.

1. Preparar soluciones de sacarosa a concentraciones de 10, 20, 30, 40 y 50

mM en una solución amortiguadora de acetato de sodio 0.1 M y pH de 4.5.
2. Preparar una solución de la enzima invertasa con una concentración de 0.1
g/L
3. La reacción enzimática será llevada a cabo a una temperatura de 40°C con
agitación magnética. En el momento que se agrega la enzima a la solución
de sacarosa para iniciar la reacción, tomando muestras cada 20 segundos
durante 2 min.
4. Adicionar de 100 μL de una solución de la enzima invertasa a un tubo
conteniendo 5 mL de una solución de sacarosa a concentraciones de 10,
20, 30, 40 y 50 mM
5. En el momento que se agrega la enzima tomar en un tubo de baquelita
muestras de 200 μL de la mezcla de reacción cada 20 segundos durante 2
min. La hidrólisis de la sacarosa será determinada por el método del DNS,
descrito por Sumner y Howell (1935). Este método consiste en la
determinación de azúcares reductores.
6. La actividad enzimática de la muestra será detenida por la adicción de 200
μL del reactivo de DNS.
7.Las muestras se somete a un baño de agua hirviendo durante 5 min.
8. Posteriormente los tubos se llevan a un baño de agua fría para detener la
reacción de la muestra.
9. Posteriormente se le agrega 2 mL de agua destilada.
10. Leer en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 540 nM
La evolución de la cinética es representada en función del tiempo de la reacción.
La pendiente obtenida permite determinar la velocidad inicial de producción de
azúcares reductores.

Una unidad de actividad es definida como la cantidad de invertasa que

cataliza μmol de sacarosa por minuto en condiciones óptimas de reacción.

Es importante señalar que es necesario contar con una curva de calibración a

partir de soluciones equimoleculares de D-glucosa y D-fructosa con
concentraciones comprendidas de 0.1 a 2 g/L en solución de acetato de sodio 0.1
M con respecto a la densidad óptica de un espectrofotómetro.

Diagrama de flujo de la práctica.