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LABORATORIO DE BIOQUÍMICA 502507

GUÍA 3/CONSTITUYENTES DE LA LECHE

I. EL PROBLEMA

Identificar, mediante ensayos químicos cualitativos, los principales biocompeustos presentes en la


leche, así como identificar algunos factores que afectan la estabilidad de las proteínas y que
permiten su aislamiento.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

La leche constituye uno de los alimentos más ricos en nutrientes puesto que es el único alimento de
los mamíferos recién nacidos durante un período variable según la especie.

Entre los principales biocompuestos que se encuentran presentes están las proteínas tanto solubles
en el suero, por ejemplo, la lacto-albúmina y proteínas emulsificadas como la caseína que es rica en
grupos fosfato. Igualmente dentro de los carbohidratos está el disacárido lactosa, conocido como
azúcar de la leche. También es rica en grasas, vitaminas y minerales. Este alimento es ideal para
el lactante y solo presenta deficiencias en hierro y vitamina C.

La composición química de la leche varía en las distintas especies y dentro de las mismas según los
períodos de lactancia, la dieta ingerida y secreción hormonal.

DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS

La desnaturalización consiste en el desdoblamiento total o parcial de la conformación nativa


de una cadena polipeptídica o una proteína. Consiste en romper las fuerzas que estabilizan la
estructura secundaria, es decir, los puentes de hidrógeno entre enlaces peptídicos y/o terciaria o
cuaternaria, como las fuerzas esquematizadas en la figura 1.

FIGURA 1

1) Puentes disulfuro. 3) Puente de hidrógeno.


2) Puente salino o interacción electrostática. 4) Interacción hidrofóbica.
Las proteínas tal como se encuentran dentro de las células o en los fluidos
corporales, tienen una conformación nativa y se encuentran solubilizadas en
soluciones coloidales o suspensiones coloidales, si se producen ciertas
alteraciones en las condiciones del medio acuso las proteínas se desdoblan
pierden solubilidad y precipitan o coagulan.

Diversos agentes desnaturalizantes pueden inducir estas alteraciones como la


agitación, el cambio de temperatura, la adición de sustancias ácidas o básicas,
sales, metales pesados, reactivos con grupos tiol, solventes orgánicos, etc.

La desnaturalización es una propiedad selectiva de gran utilidad durante los


procesos de aislamiento y purificación de proteínas, ya que no todas la proteínas
reaccionan de igual forma ante un cambio en el medio donde se encuentra
disuelta.

III. MATERIAL EQUIPOS Y REACTIVOS

Material biológico:
Leche entera cruda

Material y equipo de laboratorio, de uso general

Balanza con precisión de décima de gramo


Gasa o muselina y papel de filtro
Lámpara de luz ultravioleta
5 potenciómetros
Centrífugas
Papel indicador universal

Material por grupo de trabajo

20 tubos de ensayo- gradilla 1 pipeteador


1 vaso de precipitados de 250 mL 1 pinza para tubo
2 vasos de precipitados de 150 mL 1 microespátula
2 pipetas graduadas de 5 mL 4 goteros plásticos
1 embudo de vidrio mediano 1 aro con nuez
1 erlenmeyer de 150 mL 4 tubos de centrífuga
1 placa de calentamiento
1 vaso de precipitados de 400mL

Reactivos

Ácido clorhídrico 10% (200 mL)


Acido nítrico concentrado (200 mL)
Acido sulfúrico concentrado ( 50 mL)
Acetato de plomo 0,1M (500 mL)
Hidróxido de sodio 40% (300 mL)
Hidróxido de sodio 1% (300 mL)
Hidróxido de sodio 10% (300 mL)
Hidróxido de sodio al 20% (300 mL)
Carbonato de calcio sólido ( 20 g)
Reactivo de Biuret (500 mL)
Reactivo de Benedict (200 mL)
KCl sólido
Alcohol isobutílico
Solución de oxalato de amonio al 4%
Ferrocianuro de potasio 1%
Reactivo de Hopkins Cole FRESCO: ácido acético impurificado con trazas de
ácido glioxílico(100mL).

IV. PROCEDIMIENTO

1.Tratamiento preliminar de la muestra

Colocar en un vaso de precipitados 50 mL de leche y 50 mL de agua destilada,


añadir gota a gota y con agitación suave ácido clorhídrico al 10 % hasta que se
observe que la leche se “corta” (formación de un precipitado floculento). Controlar
con papel indicador universal o con el potenciómetro que el pH de la mezcla no
sea menor de 4,0 ni mayor de 5,0, si hay un exceso de ácido, adicionar NaOH al
1% gota a gota y con agitación suave, hasta ajustar el pH. Dejar en reposo por
unos minutos, filtre sobre un pedazo de gasa o de muselina y luego si es
necesario realice una segunda filtración sobre papel filtro, separe el precipitado
del filtrado.

Divida el filtrado en tres fracciones de aproximadamente 10mL cada una


(fracciones A y B y C)

2. Identificación de proteína y vitaminas

De la fracción A tome en un tubo de ensayo 5mL y adicione 1 gramo de


carbonato de calcio, calentar en un baño maría a ebullición, dejar en reposo hasta
que precipite, centrifugar y reservar el sobrenadante para las pruebas de
vitaminas. Sobre el precipitado adicione 20 gotas del reactivo de Biuret. Observar.

Con el sobrenadante que reservó realice los ensayos de reconocimiento de otras


proteínas y vitaminas:

2.1. Identificación de tiamina

A 5 mL de la fracción A del filtrado en un tubo de centrifuga, añadir


aproximadamente 0,3 g de KCl, 1 mL de ferrocianuro de potasio 1% y 1,5 mL de
NaOH al 10%. Mezclar y disolver completamente el KCl. Añadir 5 mL de alcohol
isobutílico, agitar por 2 minutos cuidadosamente y centrifugar por 2 minutos a
2000 rpm. Colocar el tubo en la fuente de luz ultravioleta y observar la
fluorescencia en la capa alcohólica, la cual será proporcional a la concentración de
tiamina.
2.2 Reconocimiento de riboflavina

En un tubo de ensayo colocar 1 mL de la fracción A del filtrado (debe estar bien


transparente o claro) y observar a la luz ultravioleta, la fluorescencia indica la
presencia de riboflavina.

2.3 Identificación de proteínas

Para la fracción B del filtrado caliente en un baño maría a ebullición máximo por 10
minutos y al formarse un precipitado deje en reposo hasta que se decante,
centrifugue y elimine el sobrenadante. Sobre el precipitado adicione 20 gotas del
reactivo de Biuret, mezcle y observe.

Para el ensayo de proteínas sobre la fracción sólida retenida en la gasa, tome una
pequeña cantidad del sólido colóquela en tubo de ensayo adicione 20 gotas del
reactivo de Biuret, mezcle y observe.

3.Identificación de minerales

Realice la siguiente prueba utilizando la fracción C del filtrado.

3.1Reconocimiento de calcio

Colocar en un tubo de ensayo 3 mL del filtrado C y adicionar 1 mL de oxalato de


amonio al 4%, centrifugue, si es necesario y observe la formación de un
precipitado blanco de oxalato de calcio.

4.Reconocimiento de carbohidrato

En un tubo de ensayo colocar 3 mL del filtrado C, sí el pH no es básico ajustarlo a


pH 8 y adicionar 1 mL de reactivo de Benedict, agitar y colocar al baño maría en
ebullición; observar la formación de un precipitado.

5.Reconocimiento de aminoácidos

5.1.Reacción con acetato de plomo alcalino

En un tubo de ensayo coloque 3mL del filtrado C y en otro tubo una pequeña
fracción del sólido retenido en la gasa, adicione 2 mL de solución de NaOH al 20%
y luego 20 gotas de solución de acetato de plomo 0,1 M. Caliente los tubos al
baño maría en ebullición por 5 minutos y observe. La formación de un precipitado
gris oscuro, café o negro es prueba positiva para aminoácidos azufrados como la
cisteína
5.2.Reacción xantoproteíca

En un tubo de ensayo coloque 3mL del filtrado C y en otro tubo una pequeña
fracción del sólido retenido en la gasa, adicione 1 mL de HNO3 concentrado y
caliente al baño maría. Luego enfríe en un baño con agua –hielo y adicione gota a
gota una solución de NaOH al 40% agitando cuidadosamente y en frío. El color
amarillo que vira a naranja es prueba positiva para Tirosina y Triptófano.

5.3Reacción de Hopkins Cole

En un tubo de ensayo coloque 3mL del filtrado C y en otro tubo una pequeña
fracción del sólido retenido en la gasa. Adicione 2 ml del reactivo de Hopkins Cole.
Mezcle bien el contenido y adicione a cada tubo por las paredes lenta y
cuidadosamente, sin mezclar 1 mL de ácido sulfúrico concentrado, la formación de
un anillo violeta en la interfase es prueba positiva para el triptófano.

V. BIBLIOGRAFÍA.
Berg, J.; Tymozco, J. y Stryer, L. (2008). Bioquímica. 8 ed. España: Reverté.

Cheftel, J. C. (1986). Proteínas alimentarias. España: Acribia,

Plummer, D. Bioquímica Práctica. (1981). México: McGraw Hill Latinoamericana.

Rendina, G. (1974).Técnicas de Bioquímica aplicada. México: Interamericana.

Laboratorio de Bioquímica, Prácticas para la carrera de Biología. (1995).


Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias, Departamento de
Química, Bogotá.
PREINFORME / CONSTITUYENTES DE LA LECHE
Nombre_____________________________________________ Grupo____

No olvide que se realizará un quiz virtual sobre el contenido del preinforme.


1.Consulta

1.Tabla con composición promedio de la muestra de leche en carbohidratos,


lípidos, proteínas, aminoácidos, vitaminas y calcio. (recuerde escribir unidades de
concentración).

2.Tabla de composición promedio con nombres de proteínas y aminoácidos de las


diferentes fracciones de la leche (suero y caseínas), recuerde colocar unidades
de concentración.

3.Consulte el o los nombres de la(s) proteína(s) que se puede(n) desnaturalizar al


colocar la leche entera a pH de entre 4-5 y relacione este procedimiento con la
precipitación isoeléctrica.

4.Consulte el o los nombres de la(s) proteína(s) del suero de la leche que se


puede(n) desnaturalizar al calentar hasta ebullición.

5.Consulte el o los nombres de la(s) proteína(s) del suero de la leche que se


puede(n) desnaturalizar al agregar carbonato de calcio.

2. Fichas técnicas
Propiedades de los reactivos a usar en el laboratorio
Nombre Fórmula Aspecto Peligrosidad* Forma de desechar

Ácido HCL Liquido guantes de seguridad; mascarilla;


clorhídrico
incoloro gafas de seguridad,bata.

-aire limpio, reposo , quitar ropa


contaminada ,aclara la piel con agua
,enjuagar ojos durante varios minutos
,enjuagar boca y no provocar el
vomito
Asistencia medica
Ácido nítrico HNO3 Liquido guantes de seguridad; mascarilla;
incoloro a gafas de seguridad, bata.
amarillo
-aire limpio, reposo ,posición de
semilincorporado quitar ropa
contaminada ,aclara la piel con agua
,enjuagar ojos durante varios minutos
,enjuagar boca , proporcionar
asistencia medica
Ácido sulfúrico H2SO4 Liquido guantes de seguridad; mascarilla;
gafas de seguridad, bata.
incoloro
-aire limpio, reposo ,posición de
semilincorporado quitar ropa
contaminada ,aclara la piel con agua
,enjuagar ojos durante varios minutos
,enjuagar boca , proporcionar
asistencia medica
Acetato de (CH3COO)2 Cristales Aire limpio, reposo y proporcionar,
plomo
Pb incoloros Quitar las ropas contaminadas y aclarar la
piel con agua abundante o ducharse.,
Enjuagar con agua abundante durante
varios minutos (quitar las lentes de
contacto si puede hacerse con facilidad)
Enjuagar la boca. Provocar el vómito
(¡UNICAMENTE EN PERSONAS
CONSCIENTES!) y proporcionar
asistencia médica.
Hidróxido de NaOH Polvo guantes de seguridad; mascarilla;
sodio blanco , gafas de seguridad,bata.
o
esferas
-aire limpio, reposo , quitar ropa
contaminada ,aclara la piel con agua
,enjuagar ojos durante varios minutos
,enjuagar boca y no provocar el
vomito
Asistencia medica
Carbonato de CCaO₃ en caso de contacto con la piel: lavar con
calcio
abundante agua.
- en caso de contacto con la piel: lavar
con abundante agua.-ç- en caso de
contacto con la piel: lavar con abundante
agua.
Ácido acético Aire limpio, reposo. Posición de
semiincorporado, Quitar las ropas
contaminadas. Aclarar la piel con agua
abundante o ducharse durante 15 minutos
como mínimo, Quitar las ropas
contaminadas. Aclarar la piel con agua
abundante o ducharse durante 15 minutos
como mínimoEnjuagar la boca. NO
provocar el vómito. Dar a beber un vaso
pequeno de agua
Acido glioxílico

Cloruro de
potasio
Oxalato de
amonio
Alcohol
isobutílico
,(Biuret)
Sulfato de
cobre
(Biuret)
Tartrato de
sodio y de
potasio
(Benedict)
Carbonato
anhídrido de
sodio
*Indique la peligrosidad con el símbolo correspondiente: explosivo (E), comburente (O), inflamable

(F), extremadamente inflamable (F+), tóxico (T), muy tóxico (T+), corrosivo (C), nocivo (Xn),
irritante (Xi) y/o peligroso para el medio ambiente (N). SGA

4..Procedimiento en diagrama de flujo y resultado esperado para cada prueba:


DIAGRAMA DE FLUJO

Vaso de precipitado
50 ml de leche
50 ml de agua destilada

Observar
que se corta

Añadir gota Agitación


a gotas suave
HCl al 10%

Agitar suavemente Controlar el


pH entre 4-
Controlar pH con 5
NaOH
Dejar reposar Y Filtrar con Gasa Hacer 2
filtraciones

Separar el Filtrado en 3 Fracciones

4.1. Identificación de proteínas en la fracción

esultados esperados ________________________________________________


_________________________________________________________________
__________________________________________________________________
________________________________________________________________
4.2 Identificación de proteínas en la fracción B

4.1. Identificación de proteínas en la fracción

Tubo de ensayo
1gramo de Carbonato de
Calcio

Calentar en baño de María Dejar precipitar


1ml anhídrido acético

Mezclar

Centrifugar Conservar el
sobrenadante
20 gotas del Reactivo de
(vitaminas)
biuret
Observar

Resultados esperados
________________________________________________
_________________________________________________________________
__________________________________________________________________
________________________________________________________________

4.3 Identificación de proteínas en sólido retenido en la gasa

Resultados esperados
________________________________________________
_________________________________________________________________
__________________________________________________________________
________________________________________________________________
4.4 Identificación de tiamina

Tubo de centrifuga
5 ml Fracción del filtrado

0,3 gramos de KCl

1 ml de ferrocianuro de
potasio 1%
1,5 ml NaOH al 10%
Asegurarse de
disolver todo el
Mezclar KCl
5 ml de alcohol isobutirico

Agitar por 2 minutos

Centrifugar por 2 minutos


Resultado esperados ________________________________________________
_________________________________________________________________
__________________________________________________________________
________________________________________________________________

4.5 Identificación de riboflavina

Tubo de ensayo
1ml de fracción A del Debe estar bien
filtrado trasparente

Observe en luz ultravioleta

Resultados esperados
________________________________________________
_________________________________________________________________
__________________________________________________________________
________________________________________________________________

4.6 Identificación de calcio (minerales)

Tubo de ensayo
Adicione 3ml del filtrado C

Si es necesario

1ml oxalato de amonio al 4


%
Centrifugar
Observar

Resultados esperados
________________________________________________
_________________________________________________________________
__________________________________________________________________
________________________________________________________________

4.6 Identificación de carbohidrato

Tubo de ensayo
Adicionar 3 ml del filtrado Ajustar a pH 8
C

1ml del reactivo de benedict

Agitar

Colocar en baño de maría

Observar

Resultados esperados________________________________________________
_________________________________________________________________
__________________________________________________________________
________________________________________________________________
4.7 Reacción con acetato de plomo alcalino

Tubo de ensayo
Adicionar 3 ml del filtrado C Repetir para la Fracción
del solido retenido en gasa

2ml de solución NaOH

Por 5 minutos
20 gotas de solución acetato de
Plomo 0,1M
Calentar en baño de maria

Colocar en baño de maría

Observar

Resultados esperados
________________________________________________
_________________________________________________________________
__________________________________________________________________
________________________________________________________________
4.8 Reacción xantoproteíca

Tubo de ensayo
Adicionar 3 ml del filtrado C Repetir para la Fracción
del solido retenido en gasa

1 ml de HNO3 concentrado

Calentar en baño de maria

Colocar en baño de maría Agitar en frio


Gota a gota una solución de
NaOH 40%

Agitar cuidadosamente

Resultadosesperados ________________________________________________
_________________________________________________________________
__________________________________________________________________
________________________________________________________________

4.9 Reacción de Hopkins Cole


Tubo de ensayo
Adicionar 3 ml del filtrado Repetir para la Fracción
C del solido retenido en gasa

2 ml de reactivo hopkins

¡Agregar cuidadosamente
por las paredes
Mezclar bien

1 ml de ácido sulfhídrico
concentrado

Observar

Resultado esperados ________________________________________________


_________________________________________________________________
__________________________________________________________________
________________________________________________________________

INFORME Nombre_____________________________________ / Grupo____


__________________________________________________________________

Recuerde que un factor de éxito para elaborar el informe es usar la


información de su preinforme (consulta, procedimientos y resultados
esperados) para explicar y no describir, emplear citas que correspondan
con la bibliografía, e interpretar tanto las pruebas positivas como las
negativas.

El informe debe contener:


1.-Tablas de observaciones, aclarando a la fracción de leche usada (A,B,C o
sólido en gasa) describiendo en cada caso si la prueba fue positiva o negativa y
las fotos con tubos debidamente marcados.

2-En la discusión de resultados incluya:


-El análisis de los procesos de desnaturalización realizados sobre la leche y sus
fracciones con los pasos correspondientes a la adición de ácido clorhídrico,
carbonato de calcio y calentamiento a ebullición, relacionándolos con factores
desnaturalizantes como pH y punto isoeléctrico, sales y temperatura, así como con
su efecto en la estructura e interacciones de las proteínas.
-Mencione brevemente los pasos para elaborar queso crema para untar (con
vinagre) y un postre de natas, y cómo se relacionan con los procedimientos de la
guía arriba explicados.
-Los nombres de las posibles proteínas aisladas por la desnaturalización y la
ecuación de la reacción de reconocimiento de Biuret y su explicación con base en
el fundamento químico.
-La relación con las tablas de composición de la leche.

Para cada prueba de reconocimiento de vitaminas incluya:


-Las estructuras desarrolladas de las vitaminas y la relación de estas con la
propiedad de la fluorescencia directa o de los derivados generados (tiocromo).
-La relación con las tablas de composición de la leche.

Para la prueba de reconocimiento de carbohidrato incluya:

-La ecuación de la reacción correspondiente con fórmulas desarrolladas, la


explicación del fundamento químico de la prueba y la relación con las tablas de
composición.

Para la prueba de reconocimiento de calcio incluya:

-La ecuación de la reacción correspondiente con fórmulas desarrolladas, la


explicación del fundamento químico de la prueba y la relación con las tablas de
composición.

Para cada prueba de reconocimiento de aminoácidos incluya:

-El o los grupos funcionales que reaccionaron o los responsables de la coloración


positiva del ensayo, use imágenes de fórmulas estructurales desarrolladas.

-La ecuación química correspondiente con el o los aminoácidos particulares que


pudo identificar, la relación con el fundamento químico y tablas de composición de
aminoácidos.

3.-Conclusiones: redacte una conclusión para cada prueba afirmando los


resultados obtenidos, explicando brevemente el procedimiento y las posibles
incertidumbres o errores, todo con base en la discusión de resultados.

4. Redacte la bibliografía correspondiente en normas APA.

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