Prácticas de Bioquímica Grado en Fisioterapia

PRÁCTICA 6
ESTUDIOS ENZIMÁTICOS. ACTIVIDAD DE LA AMILASA SALIVAL.
RECONOCIMIENTO DE LA CATALASA EN TEJIDOS

Objetivos
1. Identificar la acción de la amilasa de la saliva sobre el almidón
2. Identificar los productos de la acción de la amilasa sobre el almidón
3. Identificar el valor de pH óptimo de una reacción enzimática
4. Reconocer la acción de la catalasa en diversos tejidos
5. Observar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática

ACTIVIDAD DE LA AMILASA SALIVAL.

Introducción teórica
El almidón es un polisacárido formado por dos componentes:
a) Amilosa: formado por cadenas lineales de D-glucosa unidas por enlaces -
(1,4), que tienden a adoptar una estructura espacial helicoidal.
b) Amilopectina: formado por cadenas muy ramificadas. Las cadenas están
formadas por enlaces -(1,4), pero en los puntos de enlace de las ramificaciones
aparecen enlaces -(1,6) donde se enganchan unas 12 unidades de glucosa. Estas
ramificaciones aparecen también aproximadamente cada 12 glucosas. Su estructura
tridimensional es más desordenada según el número de ramificaciones

Estructura de la amilosa y la amilopectina

La −amilosa se disuelve fácilmente en agua, adquiriendo una estructura secundaria

característica, de forma helicoidal, en la que cada vuelta de hélice comprende seis
unidades glucosa. Esta estructura secundaria, en la que los grupos hidroxilo quedan
hacia afuera, permite que el iodo, al penetrar en el interior del helicoide, confiera a la
disolución una coloración azul violácea intensa característica que permite la
identificación positiva de trazas de almidón. Como esta coloración no es resultado de
ninguna interacción covalente, el calentamiento origina la desestabilización del

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helicoide y la pérdida de color, que se recupera al enfriar lentamente la disolución. La

variación en el pH tiene un efecto análogo.

Estructura repetitiva de la amilosa.

Hidrólisis del almidón.

El almidón puede hidrolizarse por medios químicos o enzimáticos.
La ebullición con ácidos o álcalis hidroliza aleatoriamente los enlaces glucosídicos entre
unidades de glucosa, dando polisacáridos de longitud intermedia denominados
dextrinas, cada vez menores hasta la obtención de unidades de glucosa individuales.
Los compuestos que se obtienen en la hidrólisis del almidón y el color que producen
con el iodo son los siguientes:
 Almidón (azul).
 Amilodextrinas (violeta).
 Eritrodextrinas (rojo).
 Acrodextrinas (incoloro*).
 Maltosa (incoloro*).
 Glucosa (incoloro*).
* Tener en cuenta el ligero color amarillo propio del iodo.

El almidón también puede hidrolizarse enzimáticamente.

Uno de los enzimas que hidrolizan el almidón es la amilasa, que se halla presente en el
jugo pancreático y la saliva. Este enzima ataca al azar los enlaces  (1→4) del interior
de la cadena. Así, rinde finalmente unidades de glucosa libre y maltosa. La amilasa no
ataca los enlaces  (1→6), base de las ramificaciones de la amilopectina.
Estos enlaces pueden ser hidrolizados por otro enzima desramificador.
La ptialina o amilasa salival es una proteína enzimática presente en la saliva. Como
todo enzima, la acción que ejerce sobre su sustrato (almidón) depende de una serie de
parámetros: pH, temperatura, concentración de enzima...
En esta práctica se intenta ver el efecto que sobre la actividad enzimática presentan
esta serie de factores.

Práctica
Material
 Tubos de ensayo
 Papel de filtro
 Pipetas
 Varilla de vidrio

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 Papel indicador de pH
 Baño de agua
 Gradilla para tubos de 10 ml

Reactivos
 Agua destilada
 HCl 0,1N
 NaOH 0,1N
 Lugol
 Reactivo de Benedict
 Disolución de almidón 1%

1. Observar el efecto del lugol sobre el almidón

a. Primero se hace un tubo patrón con 2ml de una disolución de almidón al 2 % y
unas gotas de disolución de yodo (lugol). Observar el resultado.

b. Después se calienta suavemente el tubo hasta que la mezcla pierda el color.

c. Dejar enfriar el tubo bajo el agua del grifo y esperar unos minutos. Anotar lo
sucedido.

2. Obtención del enzima.

a. Tras enjuagar la boca, se mastica un trozo de papel de filtro para estimular la
salivación. Los líquidos segregados se van pasando a un embudo con un filtro
humedecido colocado sobre un tubo de ensayo, hasta recoger la suficiente
cantidad de saliva para realizar la práctica.
b. La saliva así obtenida se diluye 1:10 con agua destilada, obteniendo así la
preparación de enzima base.
c. Colocar en un tubo 2ml de la disolución de almidón y una cierta cantidad de
saliva, mezclar bien la saliva con la disolución y calentar muy suavemente
durante unos segundos. Añadir unas gotas de lugol. Anotar los resultados y dar
una explicación a lo ocurrido.

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3. Efecto del pH sobre la actividad amilasa salival.

a. Tomar tres tubos de ensayo y añadir respectivamente

1 2 3
ClH 0,1N 2 ml NaOH 0,1N 2 ml agua destilada 2 ml
almidón 2 % 2 ml almidón 2 % 2 ml almidón 2 % 2 ml
saliva diluída 1:10 2 ml saliva diluída 1:10 2 ml saliva diluída 1:10 2 ml

b. Agitar bien y medir rápidamente el pH de cada tubo. Para medir el pH, se toma
una gota de la disolución con una varilla limpia y seca y se humedece con ella
un trocito de papel indicador de pH, comparando el color obtenido con el de la
escala.

c. Los tres tubos se colocan en un baño de agua termostatizado a 37ºC durante

15 minutos, dejando que la amilasa vaya hidrolizando al almidón. Una vez
transcurridos los 15 minutos, se sacan los tubos y se efectúan las pruebas del
iodo y de Benedict.

Prueba del iodo o del lugol: permite identificar la presencia de almidón que con
este reactivo da un color azul-violeta característico. Tomar 1 ml de muestra de cada
uno de los tubos y añadirle unas gotas de la disolución de iodo iodurada. Si la actividad
enzimática de la amilasa no se ve afectada, catalizará la hidrólisis del almidón y por
tanto la prueba del iodo será negativa.

Prueba de Benedict: permite identificar a los azúcares reductores, obtenidos por

hidrólisis del almidón, que con esta prueba dan una coloración rojiza (el almidón no
tiene poder reductor). Tomar 1 ml de muestra de cada uno de los tubos y 0,5 ml de
reactivo de Benedict
COMPARAR y DISCUTIR los resultados de la actividad de la amilasa a los diferentes
pH. Deducir el pH en el cual la enzima es más activa.

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RECONOCIMIENTO DE LA CATALASA EN TEJIDOS

Introducción teórica

La catalasa es una enzima que se encuentra tanto en tejidos vegetales (patata,

zanahoria, lechuga, etc.) como en tejidos animales (carne, pescado, etc.) produciendo
la siguiente reacción química:

H2O2 (agua oxigenada) -----> H2O + 1/2O2 (gaseoso).

Es decir, la enzima descompone el peróxido de hidrógeno o agua oxigenada en agua y

oxígeno gaseoso, que se desprenderá en forma de burbujas en un medio acuoso.

Sin embargo, si sometemos la catalasa a altas temperaturas podremos comprobar una

propiedad fundamental de las proteínas, que es la desnaturalización. Como la catalasa
es químicamente una proteína, cuando hervimos los tejidos vegetales o animales en
los que ésta está presente, provocaremos su desnaturalización. Al perder la estructura
terciaria, perderá también la función y como consecuencia su función catalítica, por lo
que no podrá descomponer el agua oxigenada y no se observará ningún tipo de
reacción cuando hagamos la experiencia anterior con muestras de tejidos hervidos. Por
tanto, no observaremos burbujas procedentes del oxígeno gaseoso desprendido
cuando la catalasa descomponía el agua oxigenada.

Práctica
Material
 Tubos de ensayo
 Tubos con tapón
 Pipetas
 Baño de agua
 Gradilla para tubos de 10 ml
 Termómetro

Reactivos
 Agua oxigenada
 Tejidos vegetales
 Tejidos animales

1. Observar la presencia de la catalasa en los tejidos y el efecto de la

temperatura en la actividad enzimática
a. Poner en varios tubos de ensayo previamente numerados 2 g de distintos
tejidos (zanahoria, hígado, pimiento, apio).
b. Añadir 5ml de agua oxigenada a cada tubo y anotar lo que sucede.

c. Explicar lo ocurrido y ordenar los tejidos según su actividad.

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d. Repetir el proceso anterior, pero hervir antes los tejidos durante diez minutos.
e. Explicar los resultados obtenidos.

2. Actividad catalítica de la catalasa.

a. En un tubo de ensayo se coloca un trozo de hígado (o 1ml de extracto de
hígado) y 10ml de agua oxigenada.
b. Se cierra el tubo con un tapón, que se deja algo flojo para el escape de los
gases producidos en la reacción, en cuyo centro exista un orificio por el cual se
pueda introducir un termómetro. Así, hemos hecho un calorímetro.
c. Se anota la temperatura ambiente, que se toma como temperatura inicial de la
reacción, y después se va anotando las variaciones de temperatura que se
producen en el interior del calorímetro cada treinta segundos durante un
período de cinco minutos.
d. Hacer la gráfica de la reacción y explicar los resultados.