TRABAJO PRACTICO N 4: CINETICA ENZIMATICA INTRODUCCION A temperaturas fisiolgicas pocas o casi ninguna de las reacciones del metabolismo intermediario

podran ocurrir a una velocidad suficiente como para permitir el mantenimiento y crecimiento celular. Para que las molculas reaccionen es necesario entregarles cierta energa adicional, llamada energa de activacin (Ea). Una manera de incrementar la velocidad de reaccin es disminuyendo la Ea. Las enzimas son catalizadores biolgicos que selectivamente disminuyen la Ea de reacciones qumicas vitales. El paso esencial en el estudio de una enzima es seguir la variacin en el tiempo de la concentracin de un reactivo (sustrato) o de un producto (medida de la velocidad) de la reaccin catalizada. Los mtodos analticos que se usan dependen de la naturaleza de los sustratos y productos. Mtodos directos: En las reacciones biolgicas existen frecuentemente diferencias espectrofotomtricas medibles entre reactivos y productos por lo que pueden detectarse por este medio variaciones en la concentracin de uno de ellos sin que el otro interfiera. Mtodos indirectos: Cuando el reactivo o el producto no absorben ni emiten luz se los puede hacer reaccionar con otra molcula tal que el producto sea espectrofotomtricamente o fluoromtricamente activo. Para cuantificar fluorescencia se mide la emisin de luz por molculas excitadas. Mtodos de titulacin: En muchas reacciones enzimticas se consumen o liberan protones, por lo tanto, un procedimiento general para seguir el transcurso de una reaccin qumica es medir la cantidad de cido o de base requerida para mantener constante el pH. Todas estas mediciones se pueden hacer en forma continua o discontinua en el tiempo. En este ltimo caso, se toman alcuotas a distintos tiempos y se detiene rpidamente la reaccin por inactivacin de la enzima en condiciones que no alteren las concentraciones de sustrato y producto. Objetivos: 1) Verificar experimentalmente algunas propiedades de la reaccin enzimtica catalizada por la Fofatasa cida de germen de trigo 1-a: Estimar la cantidad de enzima adecuada para realizar las mediciones en el tiempo del TP 1-b: Cuantificar la formacin de producto en el tiempo a diferentes concentraciones de sustrato en presencia o ausencia de un inhibidor. 1-c: Estimar Km y Vm e identificar el tipo de inhibidor. METODOLOGA Reactivos: Homogenato*: Se utilizar como extracto enzimtico el homogenato de germen de trigo preparado en el primer trabajo conservado a - 20 oC. -Buffer acetato 0,2 M pH 5,0 (buffer a pH ptimo para la reaccin enzimtica) -KOH 0,1 M (medio alcalino para detener la reaccin) -pNPP 25 mM en acetato 0,2 M pH 5 (Sustrato en buffer de reaccin)

-pNP 0.24 mM en KOH 0.1 N (producto para realizar la curva de calibracin) -fosfato de sodio (NaH2PO4) 100 mM pH 5,0 (inhibidor) PLAN DE TRABAJO 1 Da: - Confeccin de la curva de calibracin para la deteccin espectrofotomtrica del producto. - Realizacin de curvas de tiempo para distintas concentraciones de enzima. Curva de Calibracin 0,24 mM pNP en OHH2O 0,1 N KOH (ml) (ml) (ml) 1 3 3 2 0,1 3 2,9 3 0,25 3 2,75 4 0,5 3 2,5 5 1 3 2 6 1,5 3 1,5 7 2 3 1 Mezclar bien y leer absorbancia a 410 nm. Graficar la curva de calibracin. Tubo n Curvas de tiempo Se determinar la dilucin adecuada de la preparacin enzimtica que permita obtener liberacin de pNP en forma lineal con el tiempo. Se ensayarn 4 tiempos (0, 10, 20 y 30 minutos) de reaccin para las 3 concentraciones distintas de extracto enzimtico. Importante: Antes de largar las reacciones, tener preparados 16 tubos con 3 ml de KOH (0,1 N) + 2 ,5 ml de H2O (debidamente rotulados). La reaccin se realizar, en cada tubo, de la siguiente manera: - colocar el tubo con los reactivos (buffer sustrato y agua) en bao a 37 C y esperar unos minutos (preincubacin) - iniciar la reaccin con el agregado del extracto (a cada tubo la cantidad correspondiente) - a los tiempos fijados (0, 10, 20 y 30 min) tomar 0,5 ml de la mezcla de incubacin (tubos 14) y transferirlos a un tubo con KOH. - medir A410 nm de los tubos com KOH. Protocolo de incubaciones para las curvas de tiempo: Tubo n Enzima buffer acetato pNPP 25 mM H2O (ml) # (ml) 0,2 M (ml) (ml) 1 0 1,1 0,2 1,7 2 0,1 1,1 0,2 1,6 3 0,3 1,1 0,2 1,4 4 0,9 1,1 0,2 0,8 #Nota: consultar la dilucin de la enzima (homogenato).

Resultados Confeccionar la curva de calibracin Calcular los moles de pNP formada en cada reaccin (ojo a las diluciones!!) Determinar las condiciones de reaccin de cada ensayo: concentracin de sustrato, de buffer y dilucin de la enzima. Graficar el producto formado en funcin del tiempo para cada dilucin de enzima (un solo grfico). Determinar la dilucin de enzima adecuada para obtener formacin de producto en forma lineal con el tiempo, teniendo en cuenta las futuras mediciones (da 2). 2 Da - Determinacin de la actividad enzimtica a diferentes concentraciones de sustrato. - Anlisis del efecto inhibitorio del fosfato inorgnico. Protocolo para: Determinacin de la actividad enzimtica a diferentes concentraciones de sustrato en presencia o ausencia de fosfato inorgnico. La preparacin enzimtica diluida adecuadamente (segn se determin en la primera parte de este trabajo prctico) se incubar con distintas concentraciones de sustrato (0,5; 0,75; 1,5; 4 y 8 mM de pNPP) ) (solucin madre 25 mM) en presencia y ausencia de fosfato de sodio 10 mM (solucin madre 100 mM). En base a estos datos confeccionar el correspondiente protocolo para el desarrollo del trabajo prctico. El volumen final ser de 3 ml. Para cada concentracin de sustrato fosfato se realizar una pequea curva de tiempo (0, 10 y 20 min) manteniendo las mismas condiciones del ensayo anterior (da 1). Los distintos grupos de cada turno trabajarn con todas las concentraciones de sustrato por duplicado, realizando algunos grupos las mediciones en presencia de inhibidor y otros en ausencia del mismo. Utilizar el mismo bao de incubacin para las mediciones con y sin inhibidor. Una vez realizadas las reacciones y medida la Abs 410 calcular la cantidad de producto formada. Resultados Graficar las curvas de tiempo y en base a ellas, calcular la actividad (moles pNP formados/min/ml de dilucin enzimtica) para cada concentracin de sustrato fosfato. Con los datos de los dems grupos, confeccionar un grfico de Lineweaver-Burk (v-1 = f ([S]-1)) y determinar grficamente Km y Vm , en presencia y ausencia de fosfato inorgnico. Cuestionario 1- Por qu se realizaron las curvas de tiempo utilizando distintas diluciones de extracto enzimtico? 2- Si con las tres diluciones enzimticas ensayadas se obtiene formacin de producto en forma lineal con el tiempo, cul de ellas utilizara? Porqu? 3- Cul es el efecto del fosfato inorgnico en la reaccin catalizada por la fosfatasa? Es posible calcular su Ki? Justifique. Informe: Informar resultados del da 1 y 2 y responder cuestionario. Confeccionar las figuras con titulo y leyenda y numerarlas.

TRABAJO PRCTICO N5 GLUCGENO HEPTICO Introduccin Los carbohidratos, uno de los mayores grupos de sustancias orgnicas de la naturaleza, constituyen la base de varias industrias importantes, incluyendo la manufactura de azcar, papel, fibras textiles, plsticos, alimentos, fermentacin y en menor extensin drogas, vitaminas y productos qumicos. En todas las clulas vivas los carbohidratos son la fuente central de energa necesaria para realizar trabajo mecnico y reacciones qumicas. Son de especial significado en plantas, las cuales contienen desde un 50 % a un 80 % de su peso seco. Los polisacridos desempean dos funciones principales: como reserva de combustible y como elementos estructurales. Entre los polisacridos de reserva, el almidn es el que ms abunda en las plantas y el glucgeno en los animales, siendo la celulosa el material estructural ms importante en los vegetales. El glucgeno, un polisacrido de la D-glucosa con enlaces alfa 14, es la principal forma de almacenar carbohidratos. Abunda en el hgado y puede llegar a constituir el 10 % de su peso hmedo. La determinacin cuantitativa y cualitativa de monosacridos es un paso importante en la mayora de las investigaciones en la que se ven involucrados los glcidos. Los mtodos colorimtricos basados en la determinacin de grupos reductores son empleados comnmente por su sensibilidad, alta especificidad y rpida ejecucin. El anlisis cuantitativo del glucgeno presente en un rgano requiere su previo aislamiento, de modo de eliminar otras molculas que pueden interferir en su determinacin. Las protenas y cidos nucleicos precipitan cuando el homogenato del tejido es sometido a la accin de un agente desnaturalizante como el cido tricloroactico (TCA), lo que permite su rpida separacin. El glucgeno que se encuentra en la solucin remanente precipita cuando es deshidratado por el agregado de etanol y sal, con lo cual se completa su purificacin. El mtodo elegido en este trabajo prctico para la determinacin de glucgeno se basa en la medicin del poder reductor de la glucosa que lo compone. Azcares reductores: son aldosas libres o con su OH anomrico no comprometido en la unin acetlica. Las unidades de glucosa se obtienen por medio de la hidrlisis cida del mismo. El poder reductor se mide en forma indirecta por la reaccin de SomogyNelson: en una primera etapa el ion cprico se reduce en medio alcalino en caliente por el OH anomrico de la glucosa, la cual se oxida. En el reactivo de Somogy se agrega tartrato como complejante del Cu2+ para que no precipite como Cu(OH)2 en medio bsico. En una segunda etapa, por accin del Cu2O sobre el reactivo de Nelson (reactivo arseno-molbdico) se forma un complejo coloreado, en el que el Mo se ha reducido. Es justamente ese complejo el que se determina espectrofotomtricamente a 540 nm.