LABORATORIO Nº 2 DE BIOQUÍMICA DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS PROTEÍNAS I Y II

LUCY GARCIA ROJAS LORENA TORRES KLISLERTS VIVAS LUZ BENAVIDES YULIMAR BERROCAL

DOCENTE: MARTÍN NÚÑEZ CANTILLO

UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD VALLEDUPAR-CESAR

Electroforesis Cromatográfica. La reacción de biuret es para reconocer enlaces peptídico dando con las proteínas color violeta. Las estructuras secundarias y terciarias obedecen a otras fuerzas intra-moleculares. Se encuentran en el protoplasma de todas las células animales y vegetales. las que por hidrólisis producen únicamente aminoácidos. las cuales se clasifican en: SIMPLES. Fe (hemoglobina) Yodo (tiroglobulina). químicas o biológicas por ejemplo. Existen varias pruebas. Todas son ópticamente activas. las alteraciones en casos de desnaturalización se acompañan de modificaciones de las fuerzas de unión no covalentes que en última instancia establecen la forma o la geometría de las moléculas proteicas. algunas. La reacción de sakaguchi. Son biopolímeros de aminoácidos. con excepción de la glicina. de alto peso molecular. en particular puentes de hidrogeno. Millón. pueden ser Globulares (albúmina). triptófano y fenilalanina con producción de nitrocompuestos de color amarillo que se vuelven naranjados por la adición de álcalis. sin puntos de fusión característicos. Xantoproteíca. H.INTRODUCCIÓN Las proteínas son péptidos de peso molecular muy alto. La forma fundamental depende de enlaces peptídicos entre cada par de ácidos animados en su orden específico. todos presentan a nivel del grupo amino sobre el átomo de carbono alfa una configuración (L). mayor de 10. pero su composición es variable según su origen. es prueba para grupo guanidino dando color rojo. Son de naturaleza coloidal. En las proteínas naturales se encuentran 20 aminoácidos diferentes. La reacción xantoproteíca se debe a la nitración de los anillos fenilos presentes en la tiroxina. Kjeldahl. Fibrosas (fibrina de la seda) y CONJUGADAS. Los cambios de propiedades físicas. Contienen los elementos de C. En cuanto al tamaño las proteínas. . Folin Gicolteau. Sakaguchi.000. Método Van Slike. O y N y a veces otros elementos como el P (nucleoproteínas). cualitativas y cuantitativas para valorar e identificar proteínas: reacción de la Ninhidrina Biuret. los péptidos rosa pálido y las gelatinas de color azul. no obstante se han obtenido en forma cristalina.

Entender como la estructura y funcionamiento de las células y por de los organismos dependientes de las proteínas que contienen.OBJETIVOS ESPECÍFICOS Reconocer las principales propiedades de las proteínas y sus características. .

soporte y vehículo de distintas sustancias (lípidos. beta y gamma globulinas y fibrinógenos. siendo su concentración aproxima de 7 g/100ml. Ca). . alfa. también intervienen en la coagulación sanguínea y en el control de la distribución del liquido extracelular.PROTEÍNAS SÉRICAS El plasma sanguíneo contiene en solución coloidal una gran cantidad de proteínas. B12. Mediante técnicas como la electroforesis se han clasificado en fracciones o grupos: albúmina. en síntesis: nutrición celular. MATERIALES Y REACTIVOS Trípode Malla de asbesto Estufa Gradilla Goteros Balanza Pipetas Probetas Tubos de ensayo Mechero de Busen Agitador Erlenmeyer Beacker Embudo Ácido clorhídrico Ácido nítrico Ácido pícrico Ácido tánico Ácido fosfotunstico Ácido acético o Ácido tricoloacético Nitrato de plata Alcohol etílico Sulfato de cobre Cloruro mercúrico Nitroprusiato de sodio Hidróxido de sodio Hidróxido de amonio Cetona Reactivo de millón Reactivo de biuret. Las proteínas plasmáticas cumplen distintas funciones. Estas fracciones están constituidas por un conjunto de proteínas con características físico-químicas semejantes. y forman parte del sistema tampón del organismo debido a su naturaleza anfótera. Fe.

calentar y observar el color. REACCIÓN DEL BIURET Agregar a un tubo de ensayo 3ml de albúmina. más 5 gotas de reactivo de millón. Filtrar la mezcla a través de una tela fina y guardar el filtrado para los experimentos siguientes. 3. batiendo la clara de huevo por un tiempo corto y mezclándola luego con cinco veces su volumen de agua. Cuando ciertas proteínas se tratan con este reactivo se produce un color rojo o anaranjado debido a una reacción que es característica de los grupos fenólicos. Y realizar lo siguiente: Tubo 1: calentar. 3ml de solución NaOH al 10%. las proteínas que contienen tiroxina. 2. agregar 1 o 2 gotas de ácido acético diluido. 5. . COAGULACIÓN En 5 tubos de ensayo colocar porciones aproximadas de 2ml de albúmina (solución proteica). Observar y anotar. Mezclar y calentar a 37 ºC durante 10 minutos. 2 gotas de solución de sulfato de cobre al 1% y observar. observar. tratando de disolver el producto coagulado utilizando solventes comunes de proteínas (cetona). ¿A qué se debe la reacción? 4. Tubo 2: agregar 4ml de etanol Tubo 3: agregar 1ml de solución concentrada de NaOH Tubo 4: agregar 1ml de HCl concentrado Tubo 5: agregar 1ml de HNO3 Anotar observaciones y reacciones químicas. enfriar y agregar 4ml de solución de NaOH al 36% (o NH4OH). Dejar enfriar y leer la extinción. más 1 ó 2ml de ácido nítrico concentrado. OBTENCIÓN DE ALBÚMINA Preparar una solución acuosa de albúmina de huevo. REACCIÓN XANTOPROTEÍCA Esta preparación se debe a los grupos fenilos en la molécula de la proteína. REACCIÓN DE MILLÓN Agregar en un tubo de ensayo 3ml de albúmina. ¿Qué se observa? No calentar en exceso porque la solución puede desaparecer. Agregar a un tubo de ensayo 4ml de solución de albúmina.PROCEDIMIENTO 1. calentar por 10 minutos. ¿Qué sucede? Puede hacerse con trocitos de lana o seda natural. darán positivo esta reacción.

DESNATURALIZACIÓN *Ácidos Fuertes: Agregar en un tubo de ensayo 1ml de solución de proteína (albúmina) al 5%. mezclar. Observar y anotar. más 5 gotas de solución de nitrato de plata. cloruro mercurio o nitrato de plomo.6. *Iones Metálicos Pesados: agregar en un tubo de ensayo 1ml de solución de albúmina al 5% previamente alcalinizada. observar y anotar los resultados. adicionar 1ml de ácido tricloroacético. .

2. tratando de disolver el producto coagulado utilizando solventes comunes de proteínas (cetona). Y realizamos lo siguiente: En el tubo 1: sometimos a calentamiento la solución y agregamos 1 o 2 gotas de ácido acético diluido. la vertimos en un erlenmeyer.INVESTIGACIÓN 1. Luego filtramos la solución a través de una tela fina dejando el filtrado para los experimentos siguientes. COAGULACIÓN En 5 tubos de ensayo procedimos a colocar porciones aproximadas de 2ml de albúmina (solución proteica). Orifico hecho al Albúmina + Filtración de la huevo para sustraer agua solución la clara De lo anterior se concluye que la albúmina es una proteína que encuentra en casi todos los tejidos animales y además de eso se demuestra que es soluble en agua. luego la batimos por un tiempo corto y se mezcló con cinco veces su volumen de agua. OBTENCIÓN DE ALBÚMINA Al preparar la solución acuosa de albúmina. Gotas de ácido acético . Describir en orden cada una de las reacciones y dar sus conclusiones. tomamos un huevo al cual se el hizo un pequeño orifico en su parte superior para sustraerle la clara de modo que la yema no se mezclara con la clara. 1. observamos que la albúmina se disolvió en el agua. Pudimos observar que se torno de un color blanco lechoso y no se obtuvo cambios.

Por otro lado observamos que la cetona es un albúmina excelente disolvente calor orgánico. pero esta reacción se realiza de forma lenta. Al agregar HNO3 a la solución albuminita se observa que hubo una precipitación rápida y al adicionar cetona ésta disuelve la reacción tomando un amarrillo. esto es debido a que las proteínas tienen diversos factores coagulantes pero entre ellos no se encuentran las bases que es el cado del NaOH. es decir. Tuvo 4: agregamos 1ml de HCl concentrado. Observar y anotar. En el tubo 2: agregamos 4ml de etanol. etc. 3ml de solución NaOH al 10%. En el tubo 3: agregamos 1ml de solución concentrada de NaOH. grasas. Al agregarle 1ml de NaOH y de 2 a 5 gotas de alfa-naftol la solución obtuvo un color blanco. y especialmente por la transformación que ocurre en la forma nativa de la ovoalbúmina (N-ovoalbúmina) a una forma más estable (Sovoalbúmina). pero no se mostró coagulación alguna. ácidos. la albúmina se deteriora. REACCIÓN DEL BIURET Agregamos a un tubo de ensayo 3ml de albúmina.Solución más Formació Solución En esta reacción concluimos que las proteínas se pueden precipitar con formaciones de cetona n de Aplicació coágulos de al ser sometidas a temperaturas superiores a 70ºC o al ser tratadas con coágulos n de soluciones salinas. al adicionar etanol a albúmina se produce un coágulo de gran turbidez. muy utilizado por su especial capacidad para disolver compuestos apolares como los hidrocarburos. Observamos que se formó aglutinación y que al adicionar cetona ésta deshizo la coagulación. tomando la solución un color blanco lechoso. Se observó que se formaron partículas pequeñas que se fueron precipitando lentamente hasta llegar al fondo del tubo. De esta forma. 2 gotas de solución de sulfato de cobre al 1% y observamos. En el tubo 5: agregar 1ml de HNO3. etc. Mezclamos y calentamos a 37 ºC durante 10 minutos. Dejar enfriar y leer la extinción. éteres. mientras que si son factores coagulantes los alcoholes y los ácidos. De lo anterior se puede decir que al alcohol a una proteína se realiza una prueba de estabilidad que se basa en el aumento de la estabilidad térmica de las proteínas de la albúmina durante el tiempo. por lo que indica una vez mas que la cetona es un buen disolvente orgánico. ¿A qué se debe la reacción? . alcohol. 3.

como si hubiera una separación de sustancias formándose un liquido anaranjado oscuro la parte superior del tubo y otro liquido amarillento o anaranjado pero menos intenso que el anterior en el fondo del tubo. que la proteína presenta grupos fenólicos. 4. 5. Se necesitan 2 ó más uniones peptídicas para que se forme el complejo coloreado. Al calentar la solución se observa que se forma una capa amarilla gruesa. fenilalanina y triptófano y se forma un precipitado blanco que al calentar la solución cambia de color a amarillo. y ser sometido a calentamiento se observa que la solución toma un color anaranjado. Después esperamos que se enfriara la solución y le agregamos 5 gotas de nitrito de sodio y presento una efervecencia y evaporización. más 5 gotas de reactivo de millón. es decir. se nitrogenan los anillos fenílicos de los aminoácidos. REACCIÓN XANTOPROTEÍCA Agregamos a un tubo de ensayo 4ml de solución de albúmina. observamos. lo que indica que la proteína se desnaturalizó. Esta solución tomo un color violeta a amarillo caro. tiroxina. se cristalizó la albumina e hizo precipitado. El resultado anterior es debido a que al agregarle ácido nítrico a las soluciones proteicas y del aminoácido. . El hidróxido de sodio convierte el medio lo suficientemente básico de manera que ayuda a la precipitación y permite el cambio de color a anaranjado pueda darse. esta reacción se debe a que las proteínas por sus uniones peptídicas reaccionan con los iones cúpricos del reactivo en medio alcalino formando un complejo de color violeta. Observamos que al agregar a la solución de albúmina en la reacción se efectúo un aglutinamiento de color blanco y amarillento.Observamos que en la solución se produjo una reacción coloreada. más 1 ó 2ml de ácido nítrico concentrado. calentamos por 10 minutos. dejamos enfriar y agregamos 4ml de solución de NaOH al 36% (o NH4OH). REACCIÓN DE MILLÓN Al agregar en un tubo de ensayo 3ml de albúmina. esto se debe a que la reacción es positiva. se observo burbujeo luego cambio de color verdoso.

La desnaturalización destruye la actividad fisiológica de las proteínas.En esta prueba los compuestos mercúricos en medio fuertemente ácido (ácido nítrico del reactivo) se condensan con el grupo fenólico formando un compuesto de color rojo ladrillo o rojizo. Hg++ Por calentamiento . *Iones Metálicos Pesados: agregamos en un tubo de ensayo 1ml de solución de albúmina al 5% previamente alcalinizada. Observamos que hubo precipitación lo que indica que la reacción con metales pesados desnaturalizó la proteína. cloruro mercurio o nitrato de plomo. por ejemplo. f. tricloacetico… Ácidos minerales_ HCL. Así. REACCIONES DE PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS Las proteínas pueden variar sus características de solubilidad mediante alteraciones en el medio acuoso en que se hallan disueltas. se puede conseguir la precipitación mediante la adición de: a. d. conocido como desnaturalización se ejemplifica en la coagulación y endurecimiento de la clara de huevo (albúmina) inducido por el calor. 6. sustituyéndolo con grupos hidroxilo y dando como resultado proteínas desaminadas. Cu++. pícrico. etanol o iones de metales pesados alteran irreversiblemente la estructura secundaria de las proteínas. los ácidos o bases fuertes. Este proceso. b. mezclamos y observamos el ácido tricloroacético es un ácido orgánico débil que además está en baja concentración por lo que al cambiar en poco el pH la precipitación por desnaturalización de las proteínas puede darse. e. adicionamos 1ml de ácido tricloroacético. en el caso de la adición de ácido nítrico las proteínas reaccionan con el ácido nítrico liberando nitrógeno. NHO3 Iones de metales pesados: Pb++. Sin embargo. c. DESNATURALIZACIÓN *Ácidos Fuertes: agregamos en un tubo de ensayo 1ml de solución de proteína (albúmina) al 5%. Sales minerales: (NH4) Na2 SO4 Alcohol en distintas proporciones Ácidos orgánicos. más 5 gotas de solución de nitrato de plata. De lo anterior decimos que al igual que el calor.

siendo eluidas las restantes. ALGUNAS TÉCNICAS DE SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS Cromatografía de intercambio iónico. y se produce precipitación inmediata. A 2ml de disolución de clara de huevo (1x10) se añade 1ml de disolución 0. Cuando penetran en el lecho de la columna dos proteínas de tamaños tales que una penetra en los poros de las bolas de gel y la otra no. sólo puede encontrarse entre las bolas. d. carga eléctrica. En función de cual sea el criterio de separación que se aplique diferenciamos tres tipos de cromatografía en columna: Cromatografía de intercambio iónico: La cromatografía de intercambio iónico se realiza sobre matrices que tienen una carga neta. La segunda proteína. Se filtran los 4ml de mezcla y se añade al filtrado (NH) 4 SO2 cristalino hasta saturación: precipitan las albúminas. El flujo de solvente es más elevado entre las bolas que en el interior de los poros de éstas. la orina contiene albúmina. b. neutralizando de este modo la fuerza que retiene a las proteínas en la columna. en general la desnaturalización de la proteína provocada por estos procedimientos resulta irreversible. Este criterio de separación se basa en alguna propiedad que es diferentes entre las proteínas que se quieren separar: peso molecular. reduciéndose la concentración en la fase libre entre las bolas. La carga de la matriz de la columna así como la carga de las proteínas dependerá del pH del solvente y de su fuerza iónica (proporcional a la concentración de iones). se mezcla y parece un precipitado proteico. No contiene albúmina puesto que no se efectúo precipitación. En unas condiciones determinadas serán retenidas en la columna las proteínas que tengan una carga complementaria a la de la matriz del gel (las proteínas cargadas negativamente serán retenidas por una matriz cargada positivamente). electroforesis. A 2ml de orina se añaden 2 gotas de disolución saturada de acido pírico. positiva en el esquema. Para eluir las proteínas retenidas se pueden variar la carga iónica del solvente o su pH de forma que se alcance el punto isoeléctrico de la proteína de interés o el de la matriz. Esta técnica variando las concentraciones de etanol. o 2 gotas de HCl concentrado. En un tubo e ensayo se colocan 2ml de disolución proteica y se calienta a ebullición. Describir algunas técnicas de separación de proteínas.05ml de acetato de plomo ó de cloruro de mercurio (II). electroenfoque. El principio de separación de la cromatografía es la aplicación de un criterio de separación a las proteínas que se desplazan a lo largo de una matriz sólida porosa. A otra muestra de 2ml e suero humano en frío se añade 2ml de etanol. la primera se reparte entre el espacio entre las bolas y el interior de los poros. cromatografía de afinidad. c. El volumen de los poros es muy elevado y su diámetro está determinado. etc. e. las proteínas precipitan. Cromatografía de filtración en gel: La cromatografía de filtración en gel se realiza empleando unas matrices formadas por unas esferas porosas. por tamaño. Si se produce precipitación apreciable. A 2ml de suero humano se añaden 2ml de disolución saturada de (NH) 4 (SO)2 y se mezclan: precipitan las globulinas. puede utilizarse en el fraccionamiento de proteínas séricas. afinidad de una de ellas por alguna otra. filtración por gel. a.Algunas veces la precipitación es irreversible. por lo que el efecto neto es el de acelerar .

Empleando patrones de proteínas de peso molecular conocido se emplea para determinar el peso molecular de proteínas de tamaño desconocido. éstas se moverán y deberán ir pasando por la malla. Los ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negativa. con lo que migrará hacia el polo negativo hasta detenerse con carga 0.el desplazamiento de las proteínas de mayor peso molecular respecto al de las de menor peso molecular. que se consigue principalmente por dos técnicas comerciales: Anfolitos o Anfolinas: Se trata de moléculas (TOP SECRET): . más rápidamente. con lo que migrará hacia el polo positivo hasta que al ir perdiendo carga se detiene en su punto isoeléctrico. etc. variando la fuerza iónica del solvente. o el antígeno empleado en una inmunización el que recubre las bolas y que retendrá del suero del animal aquellos anticuerpos que lo reconocen (anticuerpos purificados por afinidad). En ocasiones la cromatografía de afinidad se realiza incubando el gel recubierto con el ligando directamente con la solución que contiene las proteínas a purificar. (pI). La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas (proteínas o ácidos nucleicos) según la movilidad de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa. La naturaleza del ligando es muy variada. puede ser un receptor (proteína) unido a las bolas. La elusión de la proteína afín se puede conseguir modificando las propiedades de carga del ligando (variando el pH hasta alcanzar su punto isoléctrico. Posteriormente se empaqueta la columna y se procede a la elusión. las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida. mientras que las proteínas se cargan con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente del peso molecular. Para la separación se usa un gel de agarosa o poliacrilamida (fibras cruzadas. Cromatografía de afinidad y de inmunoafinidad: En la cromatografía de afinidad las bolas de gel que conforman el lecho de la columna presentan unido en su superficie un ligando. y en segundo lugar las menores. ya que si la pones por encima de su pI tendrá carga negativa. que los dirigirá al polo positivo. o en el caso concreto de la inmunoafinidad el ligando que recubre las bolas son anticuerpos que retienen en la columna a aquellas proteínas que contienen los epítopos que reconocen. Lo bueno de la técnica es que no importa donde pongas la muestra.02 unidades. una molécula ante la que tiene afinidad una o más de las proteínas presentes en la mezcla a separar. la cual finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica. como una malla). que seleccionará su/s ligando/s de una mezcla compleja. Al atravesar la columna el ligando secuestra sobre la superficie de las bolas de gel la proteína afín. dependiendo de la técnica que se use. primero de las proteínas no unidas ('run throught') y posteriormente de las retenidas (eluido específico). Columnas largas aseguran separaciones de mayor calidad. Así. La resolución del método permite separar diferencias de pI de 0. Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico. Lo importante de la técnica es conseguir el gradiente de pH. por la que las pequeñas se moverán mejor. y tiene una gran influencia en el resultado la longitud de la columna y el volumen de la misma. Electroenfoque: se trata de la separación de péptidos o proteínas en un gradiente de pH. separándose por tanto por carga. y si se coloca por debajo de su pI tendrá carga positiva. y deja pasar el resto.) con lo que se reduce la intensidad de la interacción hasta anularla. En esta cromatografía se eluyen primero las proteínas mayores.

Se distinguen agentes físicos (calor) y químicos (detergentes. ya que como es normal migran hacia su punto isoeléctrico. como el cobre. Una vez que finaliza este proceso. El fabricante no tiene más que.Altísima capacidad taponadora. Son creadas por los ribosomas que "leen" codones de los genes y ensamblan la combinación requerida de aminoácidos por la instrucción genética. La acción de los detergentes es similar a la de los disolventes orgánicos. la proteína comienza a plegarse sin alterar su secuencia (espontáneamente. medir el pH de cada fracción y embotellar rangos de pH que saben que va a dar. la desnaturalización es un cambio estructural de las proteínas o ácidos nucleicos. Estas moléculas se sintetizan al azar. disolventes orgánicos. Las proteínas se desnaturalizan cuando pierden su estructura tridimensional (conformación química) y así su característico plegamiento de su estructura. fuerza iónica). donde pierden su estructura nativa. una vez fabricados exponerlos a un campo eléctrico y fraccionar la columna. Si la forma de la proteína es alterada por algún factor externo (por ejemplo. no es capaz de cumplir su función celular. Inertes para que no modifiquen las proteínas. La forma final de la proteína determina cómo interaccionará con el entorno. zinc e hierro. aplicándole calor. No absorben a 280 nm. Las proteínas recién creadas experimentan una modificación en la que se agregan átomos o moléculas adicionales. Las proteínas son filamentos largos de aminoácidos unidos en una secuencia específica. Éste es el proceso llamado desnaturalización. y a veces con asistencia de enzimas) de forma tal que los residuos hidrófobos de la proteína quedan encerrados dentro de su estructura y los elementos hidrófilos quedan expuestos al exterior. RTA: En bioquímica. y de esta forma su óptimo funcionamiento y a veces también cambian sus propiedades físico-químicas. pudiendo transmitir corriente aún con carga 0. Los disolventes orgánicos interaccionan con el interior hidrofóbico de las proteínas y desorganizan la estructura terciaria. Los agentes que provocan la desnaturalización de una proteína se llaman agentes desnaturalizantes. Transmiten la corriente en su pI (sin carga). pH. provocando su desnaturalización y precipitación. De bajo Pm. Como en algunos casos el fenómeno de la . teniendo la propiedad de generar un gradiente de pH al ponerlos en contacto con un campo eléctrico. Son muy solubles. PREGUNTAS 1. ácidos o álcalis). ¿Qué es la desnaturalización de una proteína? ¿Cuál es la estructura responsable? Diga por lo menos 5 agentes desnaturalizantes de las proteínas.

ya que se debe a la presencia del enlace peptídico (. Hélice de colágeno y Conformación b. Se estabilizan por la existencia de enlaces entre los radicales de los aminoácidos y la estructura cuaternaria Informa de la unión mediante enlaces débiles de varias cadenas polipeptídicas con estructura terciaria. se forma una sustancia compleja denominada Biuret. La secuencia se escribe enumerando los aminoácidos desde el extremo N-Terminal (primer aminoácido con su grupo amino libre) hasta el C-Terminal (último aminoácido con su grupo carboxilo libre). los métodos más rápidos empleados son: . Quedando en el fondo del tubo una tonalidad azul cielo reacción positiva. La secuencia determinara la forma de la proteína.NH -) que se destruye al liberarse los aminoácidos.CO. en la estructura primaria. idénticas o no. A los 2ml de peptona se le agregaron 2 gotas del reactivo de Biuret Precipitando a una coloración amarilla la reacción nos torna negativa al no haber presencia de proteínas. 2. La estructura secundaria se forma por la disposición de la secuencia de aminoácidos (estructura primaria) en el espacio. Indique la estructura del complejo que se forma en la reacción de Biuret. y por tanto. ¿Cuáles son los principales métodos de determinación de proteína totales? RTA: Los métodos para la determinación de proteínas séricas totales son muy antiguos y se basa en la determinación del nitrógeno proteico (método Kjeldahl) que aunque resulta muy exacto es muy lento y complicado. Esta estructura comienza por la secuencia de aminoácidos de la proteína. ¿Cómo puede establecerse la secuencia de aminoácidos en una proteína? ¿Cómo se separan los aminoácidos de una proteína más fácilmente? RTA: La organización de una proteína viene definida por cuatro niveles estructurales. de fórmula: Debido a dicha reacción fue que observamos que al agregar el reactivo de sulfato de cobre mas ovoalbúmina precipito a una coloración violeta. Por tanto. el pH. para formar un complejo proteico. es posible precipitar proteínas de manera selectiva mediante cambios en: la polaridad del disolvente. pero no los aminoácidos. 3. la fuerza iónica. La estructura terciaria de una proteína informa sobre la disposición de la estructura secundaria de un polipéptido al plegarse sobre sí misma. cada uno de los cuales informa de la disposición en el espacio de la anterior estructura. Cuando una proteína se pone en contacto con un álcali concentrado. RTA: La reacción de Biuret la producen los péptidos y las proteínas. 4. lo que origina una disposición globular. su función. Son frecuentes tres tipos de estructura secundaria: a-hélice. Cada cadena polipeptídica recibe el nombre de protómero. la temperatura.desnaturalización es reversible.

lo que aumenta la magnitud de la respuesta. aumentar la actividad de eliminación de las células T citotóxicas y las células NK. grupos cargados positivamente en la fase estacionaria atraen aniones del soluto. de afinidad? RTA: cromatografía De Intercambio Iónico: La cromatografía de intercambio iónico está basada en la atracción entre iones del soluto y puntos cargados que existen en la fase estacionaria. la modulación de la presentación de antígenos a los linfocitos. tanto orgánicos como inorgánicos. así como el mantenimiento de los antioxidantes exógenos. en cambio las resinas ácidas débiles se protonan a un pH próximo a 4 y pierden su capacidad de intercambio catiónico. Por lo tanto. desintoxica muchos xenobióticos (compuestos extraños) y los agentes carcinógenos. A través de la conjugación directa. de partición. especialmente el sistema inmunitario. fuertes o débiles. la síntesis de prostaglandinas. Cuál es la función del glutatión RTA: Glutatión tiene múltiples funciones:  Es el mayor antioxidante endógeno producido por las células. 5. ¿Qué es cromatografía de intercambio iónico. de exclusión molecular. Es esencial en el sistema inmunológico para ejercer todo su potencial. como las vitaminas C y E en sus formas reducidas (activas). En el caso de intercambiadores aniónicos. *Método de Lowry *Método de absorción en el ultravioleta Como muestra se utilizan sueros y exudados (líquido en el que se escapan proteínas por una disminución de la permeabilidad). el sistema gastrointestinal y los pulmones. Desempeña un papel fundamental en numerosas reacciones metabólicas y bioquímicas como la síntesis y reparación del ADN. Los valores de referencia son de 66-83 g/L para adultos y de 5. lo que influye en la producción de citoquinas y el tipo de respuesta (celular o humoral) que se desarrolla. de absorción. el transporte de aminoácidos y la activación de la enzima. Las resinas ácidas fuertes siguen ionizadas incluso en disoluciones muy ácidas. y la regulación de la apoptosis.    6. Los intercambiadores catiónicos contienen puntos cargados negativamente que atraen cationes del soluto. por ejemplo. Los grupos muy básicos de amonio cuaternario siguen siendo . la síntesis de proteínas. manteniendo así el control de la respuesta inmune. todos los sistemas del cuerpo pueden ser afectados por el estado del sistema de glutatión. Los intercambiadores iónicos se clasifican en ácidos o básicos. el sistema nervioso.*Método de Biuret y la Refractometría: Para sueros claros: Refractometría Reacción del Biuret es el método referencia.7g/dl en recién nacidos. participando directamente en la neutralización de radicales libres y compuestos de oxígeno reactivo. aumentar la proliferación de los linfocitos.

En resumen la gran variabilidad de los métodos cromatográficos se debe a las diferentes condiciones que pueden utilizarse para separar los componentes de una sustancia. Las moléculas de tamaño grande se excluyen totalmente y son eluidas en primer lugar. Una característica particular de este método es su capacidad para diferenciar compuestos isómeros en mezclas. derivados de agarosa (Sepharosa). también llamada de filtración en gel o cromatografía de permeación en gel. tener bajo contenido en grupos iónicos. Los diferentes tipos de partículas usadas deben ser estables. Este tipo de separación por tamaño difiere de las demás técnicas de cromatografía en que no existen interacciones físicas o químicas entre el analito y la fase estacionaria. el tamaño de la partícula y el flujo de elusión. de esto se deduce que el volumen disponible para las moléculas pequeñas es mayor que para las grandes. Hay diferentes tamaños de partícula para un gel: a menor tamaño mayor resolución y menor gasto en la columna. mecánica y químicamente.catiónicos a cualquier valor de pH. Los de celulosa y dextranos sirven para intercambio iónico de macromoléculas. como las proteínas. Los compuestos pueden ser derivados de dextranos (Sephadex). uniformidad de poro y tamaño. Por lo tanto las moléculas se eluyen por su tamaño decreciente. aunque en algunos casos se superponen. Ha sufrido algunas transformaciones que la han convertido en un método importante de la HPLC. Es una técnica reproducible. Es adecuada para compuestos no polares probablemente con masas moleculares inferiores a 5 000. por lo que no es muy usada con los compuestos de alto peso molecular. Los intercambiadores iónicos de poliestireno son tan grandes que las macromoléculas muy cargadas. Las únicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografía son la sílice y la alúmina. En resumen los factores que determinan la separación de las moléculas son el tamaño del poro. etc. Cromatografía De Exclusión: La cromatografía de exclusión. Cromatografía De Adsorción: La cromatografía de adsorción o Líquido-Sólido es la forma clásica de la cromatografía de líquidos. En general la cromatografía Líquido-Sólido es más adecuada para muestras que son solubles en disolventes no polares y por ello tienen solubilidad limitada en disoluciones acuosas que son las que se utilizan en cromatografía de reparto en fase inversa. En este tipo de cromatografía también se pueden separar compuestos con diferentes grupos funcionales. Cuando las separaciones exigen condiciones químicas fuertes se emplean intercambiadores iónicos inorgánicos. escalable y rápida. se pueden enlazar irreversiblemente a ellos. La fase fija está formada por partículas poliméricas o de sílice que contienen una red uniforme de poros por los que pueden penetrar las moléculas de pequeño tamaño. Los geles de intercambio iónico se usan en el caso de moléculas grandes (proteínas y ácidos nucleicos). Los métodos de la cromatografía de adsorción y reparto tienden a ser complementarios. El tiempo de elusión es proporcional al peso molecular de los mismos. . derivados de acrilamidas (Biogel P) y esferas de vidrio. Los básicos débiles de amonio terciario se desprotonan en disoluciones moderadamente básicas y pierden entonces su capacidad. Las resinas de intercambio iónico tienen aplicación en estudios donde intervienen moléculas pequeñas (PM=500) que pueden penetrar en los poros pequeños de la resina. Esta técnica se emplea en la separación de proteínas de alimentos. se basa en la diferencia de penetración de las moléculas en los poros de la fase estacionaria debido a que la separación obtenida depende del tamaño de la molécula. determinación de glucosa y fructosa en zumos de fruta. mientras que las de pequeño tamaño tienen acceso a todo el volumen poroso y son las últimas que se eluyen. siendo la primera la preferida.

porosas y uniformes. etc. como su nombre lo indica. y de fase normal cuando el recubrimiento contiene grupos funcionales polares. o el antígeno empleado en una inmunización el que recubre las bolas y que retendrá del suero del animal aquellos anticuerpos que lo reconocen (anticuerpos purificados por afinidad). y deja pasar el resto. puede ser un receptor (proteína) unido a las bolas. que seleccionará su/s ligando/s de una mezcla compleja. Estos sólidos están formados por partículas mecánicamente resistentes. aflatoxinas. una molécula ante la que tiene afinidad una o más de las proteínas presentes en la mezcla a separar. En ocasiones la cromatografía de afinidad se realiza incubando el gel recubierto con el ligando directamente con la solución que contiene las proteínas a purificar. o en el caso concreto de la inmunoafinidad el ligando que recubre las bolas son anticuerpos que retienen en la columna a aquellas proteínas que contienen los epítopos que reconocen. Esta técnica actualmente es más usada debido a que la cromatografía líquido-líquido necesita de un recubrimiento periódico de las partículas del soporte debido a la pérdida de la fase estacionaria por disolución en la fase móvil. . antioxidantes.Cromatografía de reparto: La cromatografía de reparto está formada por la cromatografía Líquido-Líquido y la cromatografía unida químicamente. La naturaleza del ligando es muy variada. Cromatografía de afinidad y de inmunoafinidad: En la cromatografía de afinidad las bolas de gel que conforman el lecho de la columna presentan unido en su superficie un ligando. la fase estacionaria se une químicamente a la superficie del soporte. variando la fuerza iónica del solvente. Estas técnicas se diferencian en la forma en que se retiene la fase estacionaria sobre las partículas del soporte relleno. Los rellenos de columna en la cromatografía de fase unida químicamente se clasifican como de fase inversa cuando el recubrimiento enlazado tiene carácter no polar. primero de las proteínas no unidas ('run throught') y posteriormente de las retenidas (eluido específico). En el segundo caso. Posteriormente se empaqueta la columna y se procede a la elusión. bebidas refrescantes entre otras.) con lo que se reduce la intensidad de la interacción hasta anularla. La elusión de la proteína afín se puede conseguir modificando las propiedades de carga del ligando (variando el pH hasta alcanzar su punto isoléctrico. Esta técnica puede utilizarse en la separación de mezclas edulcorantes artificiales. Al atravesar la columna el ligando secuestra sobre la superficie de las bolas de gel la proteína afín. . En general los soportes para casi todos los rellenos de fases unidas químicamente se preparan con sílice rígida o composiciones donde la sílice es el elemento básico.

CONCLUSIÓN En las practicas realizadas en el laboratorio de proteínas II hemos comprendido y aprendido que las moléculas de las proteínas son capaces de formar o desarrollar con el agua soluciones coloidales y que estas a su vez se pueden precipitar con formación de coágulos al ser sometidas a calentamiento o al ser tratadas con ciertas sustancias a las cuales reaccionan positivamente. esta desnaturalización se produce debido a los agentes indicados. La coagulación de toda proteína se debe al proceso conocido como desnaturalización que además es irreversible. que al entrar en contacto con la proteína destruyen su estructura terciaria y cuaternaria . .

México .es/estrucproteinas temas-estudio.org/apuntes/proteinas_b1 Murray.iespana.com/trabajos-tesis-monografias-resumenes www. Et al (1997): BIOQUIMICA DE HARPER.avolaje. R.BIBLIOGRAFÍA INTERNET biozoot. Editorial El Manual Moderno.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful