LABORATORIO Nº 2 DE BIOQUÍMICA DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS PROTEÍNAS I Y II

LUCY GARCIA ROJAS LORENA TORRES KLISLERTS VIVAS LUZ BENAVIDES YULIMAR BERROCAL

DOCENTE: MARTÍN NÚÑEZ CANTILLO

UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD VALLEDUPAR-CESAR

Los cambios de propiedades físicas. cualitativas y cuantitativas para valorar e identificar proteínas: reacción de la Ninhidrina Biuret. los péptidos rosa pálido y las gelatinas de color azul. mayor de 10. Folin Gicolteau. es prueba para grupo guanidino dando color rojo. algunas. pueden ser Globulares (albúmina). Son de naturaleza coloidal. Fe (hemoglobina) Yodo (tiroglobulina). químicas o biológicas por ejemplo. O y N y a veces otros elementos como el P (nucleoproteínas). sin puntos de fusión característicos. pero su composición es variable según su origen. Millón. H. En las proteínas naturales se encuentran 20 aminoácidos diferentes. las alteraciones en casos de desnaturalización se acompañan de modificaciones de las fuerzas de unión no covalentes que en última instancia establecen la forma o la geometría de las moléculas proteicas. . no obstante se han obtenido en forma cristalina. Electroforesis Cromatográfica. La reacción xantoproteíca se debe a la nitración de los anillos fenilos presentes en la tiroxina. Existen varias pruebas. Son biopolímeros de aminoácidos. triptófano y fenilalanina con producción de nitrocompuestos de color amarillo que se vuelven naranjados por la adición de álcalis. La forma fundamental depende de enlaces peptídicos entre cada par de ácidos animados en su orden específico. Xantoproteíca. con excepción de la glicina.000. en particular puentes de hidrogeno. Método Van Slike. Todas son ópticamente activas. las cuales se clasifican en: SIMPLES. La reacción de sakaguchi. Se encuentran en el protoplasma de todas las células animales y vegetales. Kjeldahl. Contienen los elementos de C.INTRODUCCIÓN Las proteínas son péptidos de peso molecular muy alto. las que por hidrólisis producen únicamente aminoácidos. de alto peso molecular. Las estructuras secundarias y terciarias obedecen a otras fuerzas intra-moleculares. La reacción de biuret es para reconocer enlaces peptídico dando con las proteínas color violeta. En cuanto al tamaño las proteínas. Fibrosas (fibrina de la seda) y CONJUGADAS. todos presentan a nivel del grupo amino sobre el átomo de carbono alfa una configuración (L). Sakaguchi.

. Entender como la estructura y funcionamiento de las células y por de los organismos dependientes de las proteínas que contienen.OBJETIVOS ESPECÍFICOS Reconocer las principales propiedades de las proteínas y sus características.

beta y gamma globulinas y fibrinógenos. B12. MATERIALES Y REACTIVOS Trípode Malla de asbesto Estufa Gradilla Goteros Balanza Pipetas Probetas Tubos de ensayo Mechero de Busen Agitador Erlenmeyer Beacker Embudo Ácido clorhídrico Ácido nítrico Ácido pícrico Ácido tánico Ácido fosfotunstico Ácido acético o Ácido tricoloacético Nitrato de plata Alcohol etílico Sulfato de cobre Cloruro mercúrico Nitroprusiato de sodio Hidróxido de sodio Hidróxido de amonio Cetona Reactivo de millón Reactivo de biuret. alfa. Mediante técnicas como la electroforesis se han clasificado en fracciones o grupos: albúmina. Ca). Fe. Estas fracciones están constituidas por un conjunto de proteínas con características físico-químicas semejantes.PROTEÍNAS SÉRICAS El plasma sanguíneo contiene en solución coloidal una gran cantidad de proteínas. Las proteínas plasmáticas cumplen distintas funciones. en síntesis: nutrición celular. también intervienen en la coagulación sanguínea y en el control de la distribución del liquido extracelular. soporte y vehículo de distintas sustancias (lípidos. . siendo su concentración aproxima de 7 g/100ml. y forman parte del sistema tampón del organismo debido a su naturaleza anfótera.

Tubo 2: agregar 4ml de etanol Tubo 3: agregar 1ml de solución concentrada de NaOH Tubo 4: agregar 1ml de HCl concentrado Tubo 5: agregar 1ml de HNO3 Anotar observaciones y reacciones químicas. REACCIÓN DEL BIURET Agregar a un tubo de ensayo 3ml de albúmina. COAGULACIÓN En 5 tubos de ensayo colocar porciones aproximadas de 2ml de albúmina (solución proteica). batiendo la clara de huevo por un tiempo corto y mezclándola luego con cinco veces su volumen de agua. Agregar a un tubo de ensayo 4ml de solución de albúmina. Filtrar la mezcla a través de una tela fina y guardar el filtrado para los experimentos siguientes. ¿Qué se observa? No calentar en exceso porque la solución puede desaparecer. darán positivo esta reacción.PROCEDIMIENTO 1. . enfriar y agregar 4ml de solución de NaOH al 36% (o NH4OH). 2. Mezclar y calentar a 37 ºC durante 10 minutos. Y realizar lo siguiente: Tubo 1: calentar. tratando de disolver el producto coagulado utilizando solventes comunes de proteínas (cetona). 5. agregar 1 o 2 gotas de ácido acético diluido. ¿A qué se debe la reacción? 4. ¿Qué sucede? Puede hacerse con trocitos de lana o seda natural. Cuando ciertas proteínas se tratan con este reactivo se produce un color rojo o anaranjado debido a una reacción que es característica de los grupos fenólicos. 3ml de solución NaOH al 10%. observar. 3. las proteínas que contienen tiroxina. calentar y observar el color. OBTENCIÓN DE ALBÚMINA Preparar una solución acuosa de albúmina de huevo. 2 gotas de solución de sulfato de cobre al 1% y observar. más 5 gotas de reactivo de millón. Observar y anotar. más 1 ó 2ml de ácido nítrico concentrado. calentar por 10 minutos. REACCIÓN XANTOPROTEÍCA Esta preparación se debe a los grupos fenilos en la molécula de la proteína. REACCIÓN DE MILLÓN Agregar en un tubo de ensayo 3ml de albúmina. Dejar enfriar y leer la extinción.

DESNATURALIZACIÓN *Ácidos Fuertes: Agregar en un tubo de ensayo 1ml de solución de proteína (albúmina) al 5%. *Iones Metálicos Pesados: agregar en un tubo de ensayo 1ml de solución de albúmina al 5% previamente alcalinizada.6. . Observar y anotar. adicionar 1ml de ácido tricloroacético. más 5 gotas de solución de nitrato de plata. observar y anotar los resultados. mezclar. cloruro mercurio o nitrato de plomo.

Orifico hecho al Albúmina + Filtración de la huevo para sustraer agua solución la clara De lo anterior se concluye que la albúmina es una proteína que encuentra en casi todos los tejidos animales y además de eso se demuestra que es soluble en agua. Luego filtramos la solución a través de una tela fina dejando el filtrado para los experimentos siguientes. tomamos un huevo al cual se el hizo un pequeño orifico en su parte superior para sustraerle la clara de modo que la yema no se mezclara con la clara. la vertimos en un erlenmeyer. Describir en orden cada una de las reacciones y dar sus conclusiones. Pudimos observar que se torno de un color blanco lechoso y no se obtuvo cambios. OBTENCIÓN DE ALBÚMINA Al preparar la solución acuosa de albúmina. 1. luego la batimos por un tiempo corto y se mezcló con cinco veces su volumen de agua. observamos que la albúmina se disolvió en el agua. Gotas de ácido acético . COAGULACIÓN En 5 tubos de ensayo procedimos a colocar porciones aproximadas de 2ml de albúmina (solución proteica). 2. tratando de disolver el producto coagulado utilizando solventes comunes de proteínas (cetona).INVESTIGACIÓN 1. Y realizamos lo siguiente: En el tubo 1: sometimos a calentamiento la solución y agregamos 1 o 2 gotas de ácido acético diluido.

Mezclamos y calentamos a 37 ºC durante 10 minutos. alcohol. grasas. Al agregarle 1ml de NaOH y de 2 a 5 gotas de alfa-naftol la solución obtuvo un color blanco.Solución más Formació Solución En esta reacción concluimos que las proteínas se pueden precipitar con formaciones de cetona n de Aplicació coágulos de al ser sometidas a temperaturas superiores a 70ºC o al ser tratadas con coágulos n de soluciones salinas. Observar y anotar. 3ml de solución NaOH al 10%. éteres. muy utilizado por su especial capacidad para disolver compuestos apolares como los hidrocarburos. esto es debido a que las proteínas tienen diversos factores coagulantes pero entre ellos no se encuentran las bases que es el cado del NaOH. De esta forma. Tuvo 4: agregamos 1ml de HCl concentrado. 2 gotas de solución de sulfato de cobre al 1% y observamos. De lo anterior se puede decir que al alcohol a una proteína se realiza una prueba de estabilidad que se basa en el aumento de la estabilidad térmica de las proteínas de la albúmina durante el tiempo. pero esta reacción se realiza de forma lenta. ácidos. etc. Se observó que se formaron partículas pequeñas que se fueron precipitando lentamente hasta llegar al fondo del tubo. mientras que si son factores coagulantes los alcoholes y los ácidos. tomando la solución un color blanco lechoso. Al agregar HNO3 a la solución albuminita se observa que hubo una precipitación rápida y al adicionar cetona ésta disuelve la reacción tomando un amarrillo. En el tubo 3: agregamos 1ml de solución concentrada de NaOH. al adicionar etanol a albúmina se produce un coágulo de gran turbidez. pero no se mostró coagulación alguna. es decir. 3. REACCIÓN DEL BIURET Agregamos a un tubo de ensayo 3ml de albúmina. la albúmina se deteriora. En el tubo 2: agregamos 4ml de etanol. En el tubo 5: agregar 1ml de HNO3. etc. Observamos que se formó aglutinación y que al adicionar cetona ésta deshizo la coagulación. Por otro lado observamos que la cetona es un albúmina excelente disolvente calor orgánico. Dejar enfriar y leer la extinción. por lo que indica una vez mas que la cetona es un buen disolvente orgánico. ¿A qué se debe la reacción? . y especialmente por la transformación que ocurre en la forma nativa de la ovoalbúmina (N-ovoalbúmina) a una forma más estable (Sovoalbúmina).

Se necesitan 2 ó más uniones peptídicas para que se forme el complejo coloreado. tiroxina. Después esperamos que se enfriara la solución y le agregamos 5 gotas de nitrito de sodio y presento una efervecencia y evaporización. esto se debe a que la reacción es positiva. REACCIÓN DE MILLÓN Al agregar en un tubo de ensayo 3ml de albúmina. REACCIÓN XANTOPROTEÍCA Agregamos a un tubo de ensayo 4ml de solución de albúmina. esta reacción se debe a que las proteínas por sus uniones peptídicas reaccionan con los iones cúpricos del reactivo en medio alcalino formando un complejo de color violeta. más 1 ó 2ml de ácido nítrico concentrado. El resultado anterior es debido a que al agregarle ácido nítrico a las soluciones proteicas y del aminoácido. se observo burbujeo luego cambio de color verdoso. Esta solución tomo un color violeta a amarillo caro. dejamos enfriar y agregamos 4ml de solución de NaOH al 36% (o NH4OH). .Observamos que en la solución se produjo una reacción coloreada. lo que indica que la proteína se desnaturalizó. 5. se cristalizó la albumina e hizo precipitado. calentamos por 10 minutos. es decir. Observamos que al agregar a la solución de albúmina en la reacción se efectúo un aglutinamiento de color blanco y amarillento. y ser sometido a calentamiento se observa que la solución toma un color anaranjado. Al calentar la solución se observa que se forma una capa amarilla gruesa. que la proteína presenta grupos fenólicos. observamos. El hidróxido de sodio convierte el medio lo suficientemente básico de manera que ayuda a la precipitación y permite el cambio de color a anaranjado pueda darse. más 5 gotas de reactivo de millón. fenilalanina y triptófano y se forma un precipitado blanco que al calentar la solución cambia de color a amarillo. 4. se nitrogenan los anillos fenílicos de los aminoácidos. como si hubiera una separación de sustancias formándose un liquido anaranjado oscuro la parte superior del tubo y otro liquido amarillento o anaranjado pero menos intenso que el anterior en el fondo del tubo.

REACCIONES DE PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS Las proteínas pueden variar sus características de solubilidad mediante alteraciones en el medio acuoso en que se hallan disueltas. pícrico. sustituyéndolo con grupos hidroxilo y dando como resultado proteínas desaminadas. se puede conseguir la precipitación mediante la adición de: a. en el caso de la adición de ácido nítrico las proteínas reaccionan con el ácido nítrico liberando nitrógeno. f. más 5 gotas de solución de nitrato de plata. b. La desnaturalización destruye la actividad fisiológica de las proteínas. De lo anterior decimos que al igual que el calor. tricloacetico… Ácidos minerales_ HCL. por ejemplo. conocido como desnaturalización se ejemplifica en la coagulación y endurecimiento de la clara de huevo (albúmina) inducido por el calor. 6. Así. d. e.En esta prueba los compuestos mercúricos en medio fuertemente ácido (ácido nítrico del reactivo) se condensan con el grupo fenólico formando un compuesto de color rojo ladrillo o rojizo. etanol o iones de metales pesados alteran irreversiblemente la estructura secundaria de las proteínas. adicionamos 1ml de ácido tricloroacético. c. NHO3 Iones de metales pesados: Pb++. Hg++ Por calentamiento . Este proceso. mezclamos y observamos el ácido tricloroacético es un ácido orgánico débil que además está en baja concentración por lo que al cambiar en poco el pH la precipitación por desnaturalización de las proteínas puede darse. DESNATURALIZACIÓN *Ácidos Fuertes: agregamos en un tubo de ensayo 1ml de solución de proteína (albúmina) al 5%. los ácidos o bases fuertes. *Iones Metálicos Pesados: agregamos en un tubo de ensayo 1ml de solución de albúmina al 5% previamente alcalinizada. Cu++. Sales minerales: (NH4) Na2 SO4 Alcohol en distintas proporciones Ácidos orgánicos. Sin embargo. cloruro mercurio o nitrato de plomo. Observamos que hubo precipitación lo que indica que la reacción con metales pesados desnaturalizó la proteína.

A 2ml de orina se añaden 2 gotas de disolución saturada de acido pírico. electroenfoque. A 2ml de disolución de clara de huevo (1x10) se añade 1ml de disolución 0. cromatografía de afinidad. Describir algunas técnicas de separación de proteínas. siendo eluidas las restantes.Algunas veces la precipitación es irreversible. sólo puede encontrarse entre las bolas. El volumen de los poros es muy elevado y su diámetro está determinado. positiva en el esquema. neutralizando de este modo la fuerza que retiene a las proteínas en la columna. por tamaño. Se filtran los 4ml de mezcla y se añade al filtrado (NH) 4 SO2 cristalino hasta saturación: precipitan las albúminas. La carga de la matriz de la columna así como la carga de las proteínas dependerá del pH del solvente y de su fuerza iónica (proporcional a la concentración de iones). En un tubo e ensayo se colocan 2ml de disolución proteica y se calienta a ebullición. Cuando penetran en el lecho de la columna dos proteínas de tamaños tales que una penetra en los poros de las bolas de gel y la otra no.05ml de acetato de plomo ó de cloruro de mercurio (II). d. El principio de separación de la cromatografía es la aplicación de un criterio de separación a las proteínas que se desplazan a lo largo de una matriz sólida porosa. Este criterio de separación se basa en alguna propiedad que es diferentes entre las proteínas que se quieren separar: peso molecular. o 2 gotas de HCl concentrado. la orina contiene albúmina. por lo que el efecto neto es el de acelerar . Para eluir las proteínas retenidas se pueden variar la carga iónica del solvente o su pH de forma que se alcance el punto isoeléctrico de la proteína de interés o el de la matriz. en general la desnaturalización de la proteína provocada por estos procedimientos resulta irreversible. Si se produce precipitación apreciable. En función de cual sea el criterio de separación que se aplique diferenciamos tres tipos de cromatografía en columna: Cromatografía de intercambio iónico: La cromatografía de intercambio iónico se realiza sobre matrices que tienen una carga neta. c. a. electroforesis. filtración por gel. carga eléctrica. afinidad de una de ellas por alguna otra. La segunda proteína. Cromatografía de filtración en gel: La cromatografía de filtración en gel se realiza empleando unas matrices formadas por unas esferas porosas. b. puede utilizarse en el fraccionamiento de proteínas séricas. las proteínas precipitan. e. No contiene albúmina puesto que no se efectúo precipitación. Esta técnica variando las concentraciones de etanol. ALGUNAS TÉCNICAS DE SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS Cromatografía de intercambio iónico. etc. El flujo de solvente es más elevado entre las bolas que en el interior de los poros de éstas. y se produce precipitación inmediata. la primera se reparte entre el espacio entre las bolas y el interior de los poros. En unas condiciones determinadas serán retenidas en la columna las proteínas que tengan una carga complementaria a la de la matriz del gel (las proteínas cargadas negativamente serán retenidas por una matriz cargada positivamente). reduciéndose la concentración en la fase libre entre las bolas. A 2ml de suero humano se añaden 2ml de disolución saturada de (NH) 4 (SO)2 y se mezclan: precipitan las globulinas. A otra muestra de 2ml e suero humano en frío se añade 2ml de etanol. se mezcla y parece un precipitado proteico.

y en segundo lugar las menores. La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas (proteínas o ácidos nucleicos) según la movilidad de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa. o el antígeno empleado en una inmunización el que recubre las bolas y que retendrá del suero del animal aquellos anticuerpos que lo reconocen (anticuerpos purificados por afinidad).) con lo que se reduce la intensidad de la interacción hasta anularla. éstas se moverán y deberán ir pasando por la malla. más rápidamente. En ocasiones la cromatografía de afinidad se realiza incubando el gel recubierto con el ligando directamente con la solución que contiene las proteínas a purificar.el desplazamiento de las proteínas de mayor peso molecular respecto al de las de menor peso molecular. Al atravesar la columna el ligando secuestra sobre la superficie de las bolas de gel la proteína afín. La elusión de la proteína afín se puede conseguir modificando las propiedades de carga del ligando (variando el pH hasta alcanzar su punto isoléctrico. En esta cromatografía se eluyen primero las proteínas mayores. Columnas largas aseguran separaciones de mayor calidad. que se consigue principalmente por dos técnicas comerciales: Anfolitos o Anfolinas: Se trata de moléculas (TOP SECRET): . Así. Para la separación se usa un gel de agarosa o poliacrilamida (fibras cruzadas. Empleando patrones de proteínas de peso molecular conocido se emplea para determinar el peso molecular de proteínas de tamaño desconocido. separándose por tanto por carga. y tiene una gran influencia en el resultado la longitud de la columna y el volumen de la misma. (pI). con lo que migrará hacia el polo negativo hasta detenerse con carga 0. Electroenfoque: se trata de la separación de péptidos o proteínas en un gradiente de pH. puede ser un receptor (proteína) unido a las bolas. las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida. variando la fuerza iónica del solvente. que seleccionará su/s ligando/s de una mezcla compleja. y si se coloca por debajo de su pI tendrá carga positiva. Lo importante de la técnica es conseguir el gradiente de pH. Posteriormente se empaqueta la columna y se procede a la elusión. ya que si la pones por encima de su pI tendrá carga negativa. por la que las pequeñas se moverán mejor. La resolución del método permite separar diferencias de pI de 0. y deja pasar el resto. que los dirigirá al polo positivo. como una malla). mientras que las proteínas se cargan con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente del peso molecular. con lo que migrará hacia el polo positivo hasta que al ir perdiendo carga se detiene en su punto isoeléctrico. una molécula ante la que tiene afinidad una o más de las proteínas presentes en la mezcla a separar. Lo bueno de la técnica es que no importa donde pongas la muestra. La naturaleza del ligando es muy variada. dependiendo de la técnica que se use. Cromatografía de afinidad y de inmunoafinidad: En la cromatografía de afinidad las bolas de gel que conforman el lecho de la columna presentan unido en su superficie un ligando. o en el caso concreto de la inmunoafinidad el ligando que recubre las bolas son anticuerpos que retienen en la columna a aquellas proteínas que contienen los epítopos que reconocen. primero de las proteínas no unidas ('run throught') y posteriormente de las retenidas (eluido específico). Los ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negativa.02 unidades. Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico. etc. la cual finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica.

donde pierden su estructura nativa. y de esta forma su óptimo funcionamiento y a veces también cambian sus propiedades físico-químicas. Si la forma de la proteína es alterada por algún factor externo (por ejemplo. ácidos o álcalis). Las proteínas recién creadas experimentan una modificación en la que se agregan átomos o moléculas adicionales. fuerza iónica). Son creadas por los ribosomas que "leen" codones de los genes y ensamblan la combinación requerida de aminoácidos por la instrucción genética. Estas moléculas se sintetizan al azar. La forma final de la proteína determina cómo interaccionará con el entorno. Se distinguen agentes físicos (calor) y químicos (detergentes. teniendo la propiedad de generar un gradiente de pH al ponerlos en contacto con un campo eléctrico. una vez fabricados exponerlos a un campo eléctrico y fraccionar la columna. como el cobre. no es capaz de cumplir su función celular. Las proteínas se desnaturalizan cuando pierden su estructura tridimensional (conformación química) y así su característico plegamiento de su estructura. aplicándole calor. Los agentes que provocan la desnaturalización de una proteína se llaman agentes desnaturalizantes. RTA: En bioquímica. La acción de los detergentes es similar a la de los disolventes orgánicos. Como en algunos casos el fenómeno de la . PREGUNTAS 1. pudiendo transmitir corriente aún con carga 0. No absorben a 280 nm. Transmiten la corriente en su pI (sin carga). Inertes para que no modifiquen las proteínas. ¿Qué es la desnaturalización de una proteína? ¿Cuál es la estructura responsable? Diga por lo menos 5 agentes desnaturalizantes de las proteínas. zinc e hierro. ya que como es normal migran hacia su punto isoeléctrico. Son muy solubles. Los disolventes orgánicos interaccionan con el interior hidrofóbico de las proteínas y desorganizan la estructura terciaria. Éste es el proceso llamado desnaturalización. y a veces con asistencia de enzimas) de forma tal que los residuos hidrófobos de la proteína quedan encerrados dentro de su estructura y los elementos hidrófilos quedan expuestos al exterior. la proteína comienza a plegarse sin alterar su secuencia (espontáneamente.Altísima capacidad taponadora. pH. la desnaturalización es un cambio estructural de las proteínas o ácidos nucleicos. Las proteínas son filamentos largos de aminoácidos unidos en una secuencia específica. disolventes orgánicos. Una vez que finaliza este proceso. El fabricante no tiene más que. medir el pH de cada fracción y embotellar rangos de pH que saben que va a dar. De bajo Pm. provocando su desnaturalización y precipitación.

idénticas o no. pero no los aminoácidos.CO. Cuando una proteína se pone en contacto con un álcali concentrado. y por tanto. Cada cadena polipeptídica recibe el nombre de protómero. Quedando en el fondo del tubo una tonalidad azul cielo reacción positiva. ¿Cómo puede establecerse la secuencia de aminoácidos en una proteína? ¿Cómo se separan los aminoácidos de una proteína más fácilmente? RTA: La organización de una proteína viene definida por cuatro niveles estructurales. cada uno de los cuales informa de la disposición en el espacio de la anterior estructura. lo que origina una disposición globular. La secuencia se escribe enumerando los aminoácidos desde el extremo N-Terminal (primer aminoácido con su grupo amino libre) hasta el C-Terminal (último aminoácido con su grupo carboxilo libre).NH -) que se destruye al liberarse los aminoácidos. La estructura secundaria se forma por la disposición de la secuencia de aminoácidos (estructura primaria) en el espacio. Hélice de colágeno y Conformación b. se forma una sustancia compleja denominada Biuret. Son frecuentes tres tipos de estructura secundaria: a-hélice. 3. La secuencia determinara la forma de la proteína. los métodos más rápidos empleados son: . 4. RTA: La reacción de Biuret la producen los péptidos y las proteínas. A los 2ml de peptona se le agregaron 2 gotas del reactivo de Biuret Precipitando a una coloración amarilla la reacción nos torna negativa al no haber presencia de proteínas. Esta estructura comienza por la secuencia de aminoácidos de la proteína. Por tanto. su función. ya que se debe a la presencia del enlace peptídico (. ¿Cuáles son los principales métodos de determinación de proteína totales? RTA: Los métodos para la determinación de proteínas séricas totales son muy antiguos y se basa en la determinación del nitrógeno proteico (método Kjeldahl) que aunque resulta muy exacto es muy lento y complicado. es posible precipitar proteínas de manera selectiva mediante cambios en: la polaridad del disolvente. La estructura terciaria de una proteína informa sobre la disposición de la estructura secundaria de un polipéptido al plegarse sobre sí misma. para formar un complejo proteico. en la estructura primaria. 2. la fuerza iónica. el pH. la temperatura. Indique la estructura del complejo que se forma en la reacción de Biuret. Se estabilizan por la existencia de enlaces entre los radicales de los aminoácidos y la estructura cuaternaria Informa de la unión mediante enlaces débiles de varias cadenas polipeptídicas con estructura terciaria. de fórmula: Debido a dicha reacción fue que observamos que al agregar el reactivo de sulfato de cobre mas ovoalbúmina precipito a una coloración violeta.desnaturalización es reversible.

de afinidad? RTA: cromatografía De Intercambio Iónico: La cromatografía de intercambio iónico está basada en la atracción entre iones del soluto y puntos cargados que existen en la fase estacionaria. el transporte de aminoácidos y la activación de la enzima. la modulación de la presentación de antígenos a los linfocitos. y la regulación de la apoptosis. de exclusión molecular. todos los sistemas del cuerpo pueden ser afectados por el estado del sistema de glutatión. Los intercambiadores iónicos se clasifican en ácidos o básicos. En el caso de intercambiadores aniónicos. la síntesis de prostaglandinas. aumentar la actividad de eliminación de las células T citotóxicas y las células NK. tanto orgánicos como inorgánicos. Desempeña un papel fundamental en numerosas reacciones metabólicas y bioquímicas como la síntesis y reparación del ADN. *Método de Lowry *Método de absorción en el ultravioleta Como muestra se utilizan sueros y exudados (líquido en el que se escapan proteínas por una disminución de la permeabilidad). lo que aumenta la magnitud de la respuesta. grupos cargados positivamente en la fase estacionaria atraen aniones del soluto. Cuál es la función del glutatión RTA: Glutatión tiene múltiples funciones:  Es el mayor antioxidante endógeno producido por las células. manteniendo así el control de la respuesta inmune. Los valores de referencia son de 66-83 g/L para adultos y de 5. la síntesis de proteínas. por ejemplo. especialmente el sistema inmunitario. de partición. participando directamente en la neutralización de radicales libres y compuestos de oxígeno reactivo. A través de la conjugación directa. Las resinas ácidas fuertes siguen ionizadas incluso en disoluciones muy ácidas. Los grupos muy básicos de amonio cuaternario siguen siendo . lo que influye en la producción de citoquinas y el tipo de respuesta (celular o humoral) que se desarrolla. ¿Qué es cromatografía de intercambio iónico. 5. el sistema nervioso. el sistema gastrointestinal y los pulmones.7g/dl en recién nacidos. como las vitaminas C y E en sus formas reducidas (activas). así como el mantenimiento de los antioxidantes exógenos. Los intercambiadores catiónicos contienen puntos cargados negativamente que atraen cationes del soluto. desintoxica muchos xenobióticos (compuestos extraños) y los agentes carcinógenos. de absorción.*Método de Biuret y la Refractometría: Para sueros claros: Refractometría Reacción del Biuret es el método referencia.    6. aumentar la proliferación de los linfocitos. fuertes o débiles. Es esencial en el sistema inmunológico para ejercer todo su potencial. Por lo tanto. en cambio las resinas ácidas débiles se protonan a un pH próximo a 4 y pierden su capacidad de intercambio catiónico.

catiónicos a cualquier valor de pH. derivados de acrilamidas (Biogel P) y esferas de vidrio. Los compuestos pueden ser derivados de dextranos (Sephadex). escalable y rápida. Las únicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografía son la sílice y la alúmina. el tamaño de la partícula y el flujo de elusión. como las proteínas. En este tipo de cromatografía también se pueden separar compuestos con diferentes grupos funcionales. En resumen la gran variabilidad de los métodos cromatográficos se debe a las diferentes condiciones que pueden utilizarse para separar los componentes de una sustancia. Es adecuada para compuestos no polares probablemente con masas moleculares inferiores a 5 000. Por lo tanto las moléculas se eluyen por su tamaño decreciente. La fase fija está formada por partículas poliméricas o de sílice que contienen una red uniforme de poros por los que pueden penetrar las moléculas de pequeño tamaño. Este tipo de separación por tamaño difiere de las demás técnicas de cromatografía en que no existen interacciones físicas o químicas entre el analito y la fase estacionaria. Ha sufrido algunas transformaciones que la han convertido en un método importante de la HPLC. determinación de glucosa y fructosa en zumos de fruta. Es una técnica reproducible. tener bajo contenido en grupos iónicos. El tiempo de elusión es proporcional al peso molecular de los mismos. Una característica particular de este método es su capacidad para diferenciar compuestos isómeros en mezclas. aunque en algunos casos se superponen. derivados de agarosa (Sepharosa). En general la cromatografía Líquido-Sólido es más adecuada para muestras que son solubles en disolventes no polares y por ello tienen solubilidad limitada en disoluciones acuosas que son las que se utilizan en cromatografía de reparto en fase inversa. En resumen los factores que determinan la separación de las moléculas son el tamaño del poro. Cromatografía De Adsorción: La cromatografía de adsorción o Líquido-Sólido es la forma clásica de la cromatografía de líquidos. etc. de esto se deduce que el volumen disponible para las moléculas pequeñas es mayor que para las grandes. Las moléculas de tamaño grande se excluyen totalmente y son eluidas en primer lugar. Cromatografía De Exclusión: La cromatografía de exclusión. mientras que las de pequeño tamaño tienen acceso a todo el volumen poroso y son las últimas que se eluyen. Los métodos de la cromatografía de adsorción y reparto tienden a ser complementarios. se pueden enlazar irreversiblemente a ellos. Cuando las separaciones exigen condiciones químicas fuertes se emplean intercambiadores iónicos inorgánicos. Los geles de intercambio iónico se usan en el caso de moléculas grandes (proteínas y ácidos nucleicos). se basa en la diferencia de penetración de las moléculas en los poros de la fase estacionaria debido a que la separación obtenida depende del tamaño de la molécula. Los básicos débiles de amonio terciario se desprotonan en disoluciones moderadamente básicas y pierden entonces su capacidad. Los intercambiadores iónicos de poliestireno son tan grandes que las macromoléculas muy cargadas. Esta técnica se emplea en la separación de proteínas de alimentos. mecánica y químicamente. Los de celulosa y dextranos sirven para intercambio iónico de macromoléculas. uniformidad de poro y tamaño. Las resinas de intercambio iónico tienen aplicación en estudios donde intervienen moléculas pequeñas (PM=500) que pueden penetrar en los poros pequeños de la resina. Los diferentes tipos de partículas usadas deben ser estables. . también llamada de filtración en gel o cromatografía de permeación en gel. Hay diferentes tamaños de partícula para un gel: a menor tamaño mayor resolución y menor gasto en la columna. siendo la primera la preferida. por lo que no es muy usada con los compuestos de alto peso molecular.

que seleccionará su/s ligando/s de una mezcla compleja. bebidas refrescantes entre otras. y de fase normal cuando el recubrimiento contiene grupos funcionales polares. o el antígeno empleado en una inmunización el que recubre las bolas y que retendrá del suero del animal aquellos anticuerpos que lo reconocen (anticuerpos purificados por afinidad). Estas técnicas se diferencian en la forma en que se retiene la fase estacionaria sobre las partículas del soporte relleno. . etc. En general los soportes para casi todos los rellenos de fases unidas químicamente se preparan con sílice rígida o composiciones donde la sílice es el elemento básico. primero de las proteínas no unidas ('run throught') y posteriormente de las retenidas (eluido específico). Los rellenos de columna en la cromatografía de fase unida químicamente se clasifican como de fase inversa cuando el recubrimiento enlazado tiene carácter no polar. como su nombre lo indica. . y deja pasar el resto. Posteriormente se empaqueta la columna y se procede a la elusión. Esta técnica actualmente es más usada debido a que la cromatografía líquido-líquido necesita de un recubrimiento periódico de las partículas del soporte debido a la pérdida de la fase estacionaria por disolución en la fase móvil. o en el caso concreto de la inmunoafinidad el ligando que recubre las bolas son anticuerpos que retienen en la columna a aquellas proteínas que contienen los epítopos que reconocen. aflatoxinas. puede ser un receptor (proteína) unido a las bolas.Cromatografía de reparto: La cromatografía de reparto está formada por la cromatografía Líquido-Líquido y la cromatografía unida químicamente. Cromatografía de afinidad y de inmunoafinidad: En la cromatografía de afinidad las bolas de gel que conforman el lecho de la columna presentan unido en su superficie un ligando. Al atravesar la columna el ligando secuestra sobre la superficie de las bolas de gel la proteína afín. una molécula ante la que tiene afinidad una o más de las proteínas presentes en la mezcla a separar. Esta técnica puede utilizarse en la separación de mezclas edulcorantes artificiales. Estos sólidos están formados por partículas mecánicamente resistentes. En el segundo caso. En ocasiones la cromatografía de afinidad se realiza incubando el gel recubierto con el ligando directamente con la solución que contiene las proteínas a purificar. porosas y uniformes. la fase estacionaria se une químicamente a la superficie del soporte. antioxidantes. La naturaleza del ligando es muy variada. variando la fuerza iónica del solvente.) con lo que se reduce la intensidad de la interacción hasta anularla. La elusión de la proteína afín se puede conseguir modificando las propiedades de carga del ligando (variando el pH hasta alcanzar su punto isoléctrico.

CONCLUSIÓN En las practicas realizadas en el laboratorio de proteínas II hemos comprendido y aprendido que las moléculas de las proteínas son capaces de formar o desarrollar con el agua soluciones coloidales y que estas a su vez se pueden precipitar con formación de coágulos al ser sometidas a calentamiento o al ser tratadas con ciertas sustancias a las cuales reaccionan positivamente. La coagulación de toda proteína se debe al proceso conocido como desnaturalización que además es irreversible. esta desnaturalización se produce debido a los agentes indicados. que al entrar en contacto con la proteína destruyen su estructura terciaria y cuaternaria . .

es/estrucproteinas temas-estudio. Editorial El Manual Moderno.org/apuntes/proteinas_b1 Murray. Et al (1997): BIOQUIMICA DE HARPER.avolaje. R. México .BIBLIOGRAFÍA INTERNET biozoot.com/trabajos-tesis-monografias-resumenes www.iespana.

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