LABORATORIO N4 DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ENZIMTICA: 1. Aspectos tericos: 1.1 -Amilasa salival y pancretica.

. La saliva es una mezcla derivada de la secrecin de 3 pares de glndulas, las partidas, submaxilar y sublingual, como tambin de pequeas glndulas mucosas ubicadas difusamente sobre la mucosa de la boca. La cantidad normal secretada en una persona adulta es de 1 a 1,5 Iitros en 24 horas. La composicin de la saliva es un 99,5% H 2O y 0,5 % de slidos orgnicos e inorgnicos, el pH oscila entre 6,2 y 7,4. Los principales componentes orgnicos son las glicoprotenas, protenas (albmina, globulinas) y carbohidratos. Los componentes inorgnicos principales son calcio, sodio, potasio, magnesio y fsforo. La secrecin pancretica es un lquido acuoso no viscoso, que tiene un contenido de H2O semejante al de la saliva y que lleva cierta cantidad de protenas y compuestos inorgnicos, principalmente Na +, K+, HCO3- y Cl-, adems estn presentes en pequeas cantidades Ca +2, Zn+2 y HPO4-2. El pH del jugo pancretico es claramente alcalino de 7,5 a 8,0 o mayor. En la secrecin pancretica se encuentran numerosas enzimas, la tripsina, amilasa, carboxipeptidasa, lipasa y otras. La enzima -amilasa, presente en la saliva, inicia la degradacin del almidn, la principal fuente de carbohidratos de la dieta humana. Esta enzima hidroliza al azar los enlaces (14) que unen residuos de glucosa en el almidn, a excepcin de los enlaces cercanos a los extremos y a los puntos de ramificacin de las cadenas. Por la accin de esta enzima activada por iones cloruro, en la boca la longitud de la cadena del almidn se reduce de varios miles a unas ocho unidades de glucosa. La alta concentracin de protones del estmago inactiva la -amilasa salival. La digestin del almidn contina en el intestino delgado por la accin de la -amilasa pancretica, como producto se forma una mezcla del disacrido maltosa, el trisacrido maltotriosa y oligosacridos conocidos como dextrinas que poseen ramificaciones (16).
almidn
amilasa

ENZIMAS DIGESTIVAS

maltosa + maltotriosa +

dextrinas Ecuacin 4.1

El almidn y dextrinas complejas al ser tratados con una solucin de yodo dan un complejo de coloracin azul, mientras que las dextrinas ms simples, la maltotriosa y maltosa no dan una reaccin positiva. As, la accin de la -amilasa sobre polisacridos puede ser seguida midiendo la decoloracin del complejo azul hasta alcanzar el punto acrmico (solucin incolora). 18

La maltosa y otros carbohidratos reductores producidos en la reaccin pueden ser detectados por el test de Benedict. Este mtodo es cualitativo, consiste en una solucin alcalina de Cu2+ que se encuentra formando un complejo con citrato. El in cprico es reducido a Cu1+ por compuestos reductores con formacin de hidrxido cuproso amarillo o de xido cuproso rojo. El cambio de coloracin o la formacin de un precipitado rojo-ladrillo (Cu 2O) indica la presencia de un compuesto reductor. Carbohidratos reductores tambin pueden detectarse y cuantificarse por los ensayos de Somogyi-Nelson y de la o-toluidina. 1.2 Lipasa pancretica, efecto de la sal biliar. La mayora de los lpidos de la dieta son triglicridos, esteroles y fosfolpidos de membrana de origen vegetal y animal. La digestin de los lpidos ocurre en el duodeno gracias a la secrecin pancretica. La lipasa pancretica acta en la interfase H 2O / aceite de las gotitas de lpidos finamente emulsificadas, formadas por la agitacin mecnica en el intestino en presencia de sales biliares. La degradacin de lpidos en el sistema digestivo es incompleta, los triglicridos son transformados a una mezcla de diglicridos, monoglicridos, glicerol y cidos grasos. La reaccin puede ser seguida por el cambio de pH causado por la disociacin de los cidos grasos formados a travs del tiempo de la reaccin ocupando un indicador cido-base, compuestos que son cidos o bases cuyas distintas formas inicas tienen diferentes colores. El rojo de fenol es un cido dbil con un intervalo de transicin entre valores de pH 6,4 y 8,0; la forma protonada es amarilla y la forma bsica es roja. Una transicin de pH de un medio neutro o alcalino a pH cido va acompaada de un cambio de coloracin, de rojo a amarillo.
Lipasa

Triglicridos

diglicridos + monoglicridos + glicerol + cidos grasos Sales biliares ( R-COO- + H+)

Ecuacin 4.2

2. Objetivos. Determinar la actividad enzimtica de las enzimas digestivas -amilasa y lipasa de acuerdo a las diferentes propiedades que presentan los reactantes y productos de las reacciones catalizadas.

19

3. Parte experimental. 3.1 Materiales bao termostatizado / termmetro trpode / rejilla / mechero espectrofotmetro / celdas 2 gradillas 2 pipetas graduadas de 10 ml 2 pipetas graduadas de 5 ml 1 pipeta graduada de 1 ml 1 pipeta graduada de 1 ml 1 pipeta graduada de 2 ml 1 pizeta 1 vaso precipitado de 100 ml 1 vaso precipitado de 250 ml 1 vaso precipitado de 500 ml 3.2 Reactivos Almidn 0,5 % en tampn fosfato 0,1 M pH 6,7 Tampn fosfato 0,1 M, pH 6,7 NaCl 1 % Reactivo de Benedict Solucin de yodo 2,5 mM Pancreatina 1 mg/ ml, como fuente de -amilasa Pancreatina 10 mg/ml, como fuente de lipasa Rojo fenol 0,8 mg/ml Na2CO3 0,5 M HCl 1,0 M Leche con 26% de material grasa Colato de sodio 5%. 4. Procedimiento. En forma previa: Diluya 1:5 la solucin stock de -amilasa 1 mg/ml. (1 ml de enzima 1 mg/ml + 4 ml de tampn fosfato 0,1M pH 6,7). Prepare una batera de tubos de ensayo rotulados con 3,0 ml de la solucin de yodo (T0I, T1I, T2I, T2I, T5I y T15I). Prepare una batera de tubos de ensayo rotulados con 5,0 ml del reactivo de Benedict (T0B, T1B, T2B, T2B, T5B y T15B).

20

4.1 Hidrlisis de almidn por -amilasa pancretica Prepare los tubos rotulados como se indica en la tabla 4.1:
TABLA 4.1

TUBOS Almidn (ml) Tampn fosfato 0,1 M (ml) NaCl 1% (ml)

B ----5,0 1,0

T 10,0 ----2,0

Nota: Es importante que se mida exactamente los tiempos indicados en el procedimiento. Coloque el tubo T en un bao de agua a 37 C durante 5 minutos. Inicie la reaccin, agregando 2,0 ml de enzima diluida 1/5 al tubo T. Mezcle sin agitacin violenta el contenido del tubo e incube inmediatamente a 37C. El momento en que agreg la enzima al tubo de ensayo se considera como tiempo cero de la reaccin. A los tiempos 0, 1, 2, 5 y 15 minutos de iniciada la reaccin enzimtica, saque 1,0 ml de la solucin T para estimar cambios de concentracin del sustrato (almidn, punto 4.1.1) y en forma paralela, 1,0 ml de la solucin T para cuantificar el producto de la reaccin (cuerpos reductores, punto 4.1.2). Nota: Es importante que una vez sacado el volumen indicado en forma inmediata inicie los procedimientos descritos en 4.1.1 y 4.1.2.

4.1.1 Estimacin semicuantitativa del almidn. Mezcle 1,0 ml del ensayo de la hidrlisis enzimtica del almidn (tubo T) obtenido al tiempo cero de reaccin con 3,0 ml del reactivo de yodo en el tubo de ensayo ya rotulado. Homogenice. Repita la operacin anterior a los diferentes tiempos de incubacin (1, 2, 5 y 15 min). Prepare el blanco con 1,0 ml del tubo B y 3,0 ml de la solucin de yodo. Lea la absorbancia a 540 nm, calibrando el equipo con el blanco. Grafique absorbancia versus tiempo de reaccin. 4.1.2 Estimacin de cuerpos reductores. Mezcle 1,0 ml del ensayo de la hidrlisis enzimtica del almidn (tubo T) obtenido al tiempo cero de reaccin con 5,0 ml del reactivo de Benedict en un tubo de ensayo ya rotulado. Homogenice. Coloque el tubo de ensayo en un bao en ebullicin por 5,0 minutos exactos. Enfre bajo llave de agua con cuidado. Repita la operacin anterior (3 pasos) a los diferentes tiempos de incubacin (1, 2, 5 y 15 min). Prepare el blanco con 1,0 ml del tubo B y 5,0 ml de la solucin de Benedict, incube en un bao de agua a ebullicin por 5 min y enfre. Lea la absorbancia a 560 nm, calibrando el equipo con el blanco. Observe si hay aparicin de un precipitado rojo. 21

Grafique absorbancia versus tiempo de reaccin.

22

4.2. Degradacin de triglicridos por la lipasa pancretica. En forma previa: En un tubo de ensayo prepare 10 ml de una suspensin de 10 mg/ml de pancreatina en agua destilada. Deje la enzima en un vaso de agua con hielo. Neutralice la leche fresca adicionando 10 ml de Na 2CO3 0,5 M a 40 ml de leche con 0,1 ml de una solucin de rojo fenol (0,8 mg/ml). Prepare 2 tubos de ensayo con 5 ml de leche neutralizada cada uno. Adicione a uno de ellos 0,4 ml de HCl 1,0 M. Estos dos tubos servirn como referencia para el cambio de color, el color rosado indica medio neutro y bsico, el amarillo indica medio cido. De acuerdo a la tabla 4.2: Prepare una batera de tubos de ensayo rotulados. Agregue la leche neutralizada que contiene el indicador. Agregue la solucin de colato de sodio. Agregue el agua destilada. Coloque los tubos en un bao de agua termostatizada a 37C durante 5,0 min. Inicie la reaccin enzimtica adicionando 2,0 ml de la solucin de pancreatina a los tubos T1 y T2. Agite y deje incubando siempre a 37C. Adicione 2,0 ml de agua destilada a los tubos controles C 1 y C2. Agite y deje incubando siempre a 37C. Anote el tiempo requerido para el cambio de color y olor desde que agreg la pancreatina, compare tambin los cambios de color y densidad en los tubos.
TABLA 4.2

Tubo Leche neutralizada (mL) Solucin de colato de Na (mL) H2O destilada ( mL)

T1 5,0 --1,0

T2 5,0 1,0 ---

C1 5,0 --1,0

C2 5,0 1,0 ---

5. Bibliografa Robert Bohinski, 1991. Bioqumica, 5 Edicin, Addison-Wesley, Iberoamericana. Preguntas. 1. Con qu propsito agrega NaCl a la reaccin de hidrlisis del almidn? 2. Usando maltosa y sacarosa como ejemplos, discuta las caractersticas de los azcares que tienen propiedades reductoras. 3. El reactivo de Benedict presenta color azul debido al cobre. Por qu en presencia de maltosa se observa un cambio de color? 4. Cul es la estructura de las sales biliares y por qu funcionan como detergentes? 5. Qu accin ejerce el colato de Na en la reaccin catalizada por la lipasa pancretica? 6. Qu puede concluir de los resultados obtenidos de los tubos C 1 y C2 con respecto al colato de Na? 23