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PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE

BIOQUÍMICA

UNIVERSIDAD TÉCNICA DE
COTOPAXI

UNIDAD ACADÉMICA CAREN

UNU
INFORME DE LAS PRÁCTICAS
DE LABORATORIO

CATEDRA: Bioquímica

DOCENTE: Ing. Galo A. Salazar E. M.Sc.

INTEGRANTES:

 Alan Caguana
 Erika Rivera
 Edwin Congacha
 Sebastián Tello

CURSO: Segundo “A” CARRERA: Ingeniería Agronómica

CICLO: Octubre 2018 – Febrero 2019


PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE
BIOQUÍMICA

PRÁCTICA # 2

1. TEMA DE LA PRACTICA
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

2. INTRODUCCION

Una enzima es una proteína que actúa como catalizador de una reacción
química acelerándola. Las enzimas son protagonistas fundamentales en los
procesos del metabolismo celular. Las enzimas unen su sustrato en el centro
reactivo o catalítico, que suele estar protegido del agua para evitar interacciones
no deseadas. En el centro reactivo la disposición espacial y los tipos de cadenas
laterales de aminoácidos son fundamentales para orientar correctamente el
sustrato y poder interaccionar de la forma deseada para llevar a cabo la catálisis
de la reacción. Las enzimas son muy selectivas en relación a los sustratos que
modifican. Las enzimas suelen ser mucho más grandes que sus sustratos y en
muchas ocasiones requieren de la participación de otras moléculas más
pequeñas no polipeptídicas como las coenzimas (biotina, NADH entre otros) o
los iones metálicos llamados cofactores.

La catálisis enzimática, esta se da por la formación de un sitio activo. Este sitio


es una región privilegiada que interactúa con substratos que a su vez se
transforman en productos. El sitio activo está constituido por aminoácidos de 4
tipos: de contacto, auxiliares, colaboradores y no colaboradores. Son los grupos
funcionales radicales de los aminoácidos los que intervienen directamente en la
catálisis. Su participación se debe a su capacidad para transferir electrones
(carácter nucleofílico) y protones (carácter ácido-básico).

La estructura terciaria es primordial para la catálisis. Permite la formación del


sitio activo ya que aproxima los aminoácidos que lo constituyen. Esta
conformación juega a la vez un rol importante en la protección del sitio activo, y
se adapta con exactitud al sustrato.
PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE
BIOQUÍMICA

La mayoría de las enzimas son de naturaleza proteica y están sujetas a el


fenómeno de la desnaturalización, si la forma de la enzima es alterada por algún
factor externo (por ejemplo, aplicándole calor, ácidos o álcalis), no es capaz de
cumplir su función celular
Las velocidades de las reacciones catalizadas por enzimas son en general
proporcionales a la primera potencia de la concentración de la enzima (son de
primer orden respecto a la enzima). Sin embargo, es frecuente encontrar una
dependencia de la concentración del sustrato (sobre el que actúa la enzima),.
La velocidad varía linealmente con la concentración de sustrato a
concentraciones bajas (primer orden respecto al sustrato) y se hace
independiente de la concentración de éste (orden cero) a concentraciones
elevadas.

Reacciones de las enzimas


El hecho de que una reacción química sea termodinámicamente favorable
depende de la diferencia de energía libre que haya entre los sustratos y los
productos. Si esta diferencia es negativa, la reacción es espontánea. Aunque
una reacción sea espontánea no significa que la velocidad de la reacción sea
elevada, existiendo reacciones espontáneas que tardan segundos y otras que
tardan horas. En las reacciones químicas sencillas la transformación de un
sustrato en un producto suele pasar por un estado intermedio llamado estado
de transición. Este estado de transición es muy inestable y suele necesitar
aporte de energía. La velocidad de una reacción química depende de esta
energía de activación.
Para que se produzca una reacción química, sin intervención de enzimas, es
necesario que los reactivos entren en contacto, para lo que es necesaria una
concentración suficiente, y que el choque de moléculas tenga energía para
superar la barrera de activación.
Este es el motivo por el que la temperatura influye en el equilibrio químico. La
enzima acelera la reacción química disminuyendo la energía de activación. La
enzima lleva a cabo esta disminución de la barrera energética interaccionando
con los elementos que participan en la reacción química estabilizándolos en el
centro reactivo.
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BIOQUÍMICA

Así, aumenta enormemente la probabilidad de que se produzca la reacción


química ya que concentra y pone en contacto los elementos necesarios para la
reacción. En algunas reacciones enzimáticas participan coenzimas que permiten
que durante la reacción la enzima no sufra modificaciones químicas que le
impidan repetir el proceso. La actividad enzimática se restaura con sólo
reemplazar la coenzima y el complejo enzimático queda listo para catalizar una
nueva reacción.

3. OBJETIVOS:

3.1. General

 Conocer la actividad de la catalasa en tejidos vegetales y animales,


mediante la realización de diferentes procedimientos en el
laboratorio, para evidenciar la actividad enzimática presentes en los
mismos

3.2 . Especificos
 Evidenciar la hidrólisis del almidón por acción de la amilasa presente
en la saliva, utilizando reactivos previamente mezclados
 Evidenciar la hidrólisis de la sacarosa por acción de la glucosidasa
de las levaduras.
 Demostrar la presencia y definir el modo de acción de otros sistemas
enzimáticos tales como polifenoloxidasas.

4. MATERIALES - REACTIVOS

MATERIALES REACTIVOS

 Tubos de ensayo  Solución de almidón


 Vasos de precipitación de  Reactivos de Fehling A y
250 ml B
 Gradilla  Lugol
 Plancha de calentamiento  Metabisulfito de sodio
 Pinzas para tubo de ensayo 1%
 Ácido clorhídrico
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BIOQUÍMICA

 Pipetas graduadas de 2, 5 y  Agua oxigenada


10 ml  Agua destilada
 Caja de Petri
 Balanza
 Zanahoria
 Hígado
 Manzana
 Rábano
 Levadura
 Azúcar
 Bisturí

5. PROCEDIMIENTO

GRUPO 1
Presencia de catalasa en tejidos animales y vegetales

Corte dos trozos de zanahoria y dos trozos de hígado introduzca cada muestra
en un tubo de ensayo, ponga 3 mL de agua destilada y ponga a hervir un tubo
con zanahoria y otro tubo con hígado en un baño maría durante 15 minutos,
pasado este tiempo deje enfriar el tubo, retire el agua y adicione 10 gotas de
peróxido de hidrógeno (H2O2) a cada tubo, observe y registre lo observado en la
siguiente tabla (Anexo 1).

GRUPO 2
Hidrólisis del almidón por acción de la amilasa

Marque 6 tubos de ensayo y realice las siguientes preparaciones:


- Tubos 1 y 2: 2 mL de solución de almidón
- Tubos 3 y 4: 2 mL se solución de almidón y 1 mL de saliva

Deje los tubos en reposo durante 30 minutos y adicione a los tubos 1,3 reactivo
de Fehling A y B previamente mezclados y a los tubos 2, 4 lugol. Reporte las
observaciones en la siguiente tabla (Anexo 2).

GRUPO 3
Hidrólisis de la sacarosa por la glucosidasa de las levaduras

Disuelva 2 gr de levadura en 20 mL de agua destilada, deje reposar esta mezcla


durante 15 minutos, filtre la mezcla y el líquido resultante es el extracto de
levadura. Prepare los siguientes tubos:
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- Tubo A: 1 gr de sacarosa más 5 mL de agua y agitar.


- Tubo B: 1 r de sacarosa ms 5 mL de agua más 3 mL de extracto de levadura
y agitar.

Adicione a cada tubo una reacción de Fehling y anote los resultados.

GRUPO 4
Acción de las polifenol-oxidasas

Corte 12 tiras delgadas de manzana y rábano de aproximadamente 5cm,


raspando los bordes para destruir células del tejido. A continuación, hierva en
un baño maría la mitad de los trozos de manzana y rábano.

Sobre una caja de Petri ponga 2 trozos de manzana y rábano sin hervir, y sobre
otra ponga 2 trozos de cada uno pero hervidos.

Enseguida, sumerja 2 trozos de manzana y rábano sin hervir en un tubo de


ensayo con solución de metabisulfito sódico. Haga lo mismo con 2 trozos de
manzana y rábano hervidos.

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Las enzimas son proteínas y por tantos se destruyen (desnaturalizan) con el


calor y con los cambios de pH. Cuando se produce la desnaturalización, la
enzima deja de ser activa y no cumple su función.
Presencia de catalasa en tejidos animales y vegetales: la catalas es una enzima
que actúa sobre el peróxido de hidrógeno (H2O2 agua oxigenada)
descomponiéndolo en H2 O y O2, con desprendimiento de energía en forma de
calor. Esta enzima está presente en todos los tejidos animales y vegetales. En
esta práctica realizaremos una desnaturalización mediante una elevación de la
temperatura.
Hidrólisis del almidón por las enzimas hidrolíticas de la saliva: En la saliva se
encuentra una enzima llamada ptialina que descompone (hidroliza) el almidón
produciendo glucosa. Vamos a comprobar la presencia de glucosa tras la acción
de la enzima realizan una reacción de Fehling. La desnaturalización de la
enzima la realizaremos cambiando el pH por medio de la adición de ácido (HCl).
Hidrólisis de la sacarosa por la glucosidasa de la levadura: La sacarosa es un
glúcido sencillo formado por la unión de glucosa y fructosa. Cuando se rompe el
enlace entre estas dos sustancias (esta reacción se llama hidrólisis) se libera
por lado glucosa y por otro, fructosa.
Estos resultados se encontraron por medios de investi!aci1n sobre la enzimas
que pueden actuar en tejidos animales como vegetales, los compuestos que trae
el MnO₂ y la importancia que esta tienen.
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BIOQUÍMICA

Se puedo establecer que la enzima que actúa en la parte del tejido animal fue la
catalasa en donde podemos encontrar una cantidad mayor que en la de los
tejidos vegetales porque estos contiene una menor cantidad de enzima.

7. CONCLUSIONES
En los diferentes resultados obtenidos se ha observado métodos para
preservar los alimentos mediante la desnaturalización de las proteínas
conservando sus propiedades nutricionales.
En la hidrolisis solo se vio cambios en la densidad del cada material en la saliva
que contiene enzimas para pre digestión de alimentos y en la solución de
almidón.
En el primer ensayo se vio la existencia de catalasa en diferentes alimentos, la
catalasa en una enzima que la podemos encontrar en muchos organismos
vivos, y cataliza la reacción de descomposición del peróxido de hidrógeno en
agua y oxígeno.
El peróxido de hidrógeno es uno de los productos del metabolismo celular en
diversos organismos, pero dada su potencial toxicidad, es transformado
enseguida por la enzima catalasa.

8. RECOMENDACIONES

 Distribuir de una manera adecuada el tiempo para poder realizar en su


totalidad la práctica
 Utilizar todos los implementos necesarios de seguridad en el laboratorio
para nuestra protección
 La realización de cada proceso para evidenciar la actividad enzimática fue
interesante y a la vez requirió de paciencia y observación, para realizar
comparaciones con lo indicado en clases

9. RESPUESTA A LAS CUESTIONES PLANTEADAS (Cuestionario)

 Investigue las enzimas encontradas normalmente en los vegetales y en


los tejidos animales.
Enzimas son moléculas de proteínas que tienen la capacidad de facilitar y
acelerar las reacciones químicas que tienen lugar en los tejidos vivos,
disminuyendo el nivel de la "energía de activación" propia de la reacción.
Enzimas reguladoras.- La célula es una máquina química que debe ser capaz
de autoajustarse o regular su propio funcionamiento para no desperdiciar
tiempo ni energía en realizar procesos que no le son útiles en un momento
dado, siguiendo así un principio de máxima economía molecular.
Los enzimas alostéricos: presentan siempre dos formas, una activa y otra
inactiva, interconvertibles por efecto del modulador.
Hidrolasas: Catalizan reacciones de hidrólisis. Rompen las biomoléculas con
moléculas de agua. A este tipo pertenecen las enzimas digestivas.
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BIOQUÍMICA

Isomerasas: Catalizan las reacciones en las cuales un isómero se transforma


en otro, es decir, reacciones de isomerización.
Ligasas: Catalizan la unión de moléculas.
Liasas: Catalizan las reacciones de adición de enlaces o eliminación, para
producir dobles enlaces.
Oxidorreductasas: Catalizan reacciones de óxido-reducción. Facilitan la
transferencia de electrones de una molécula a otra. Ejemplo; la glucosa (en las
frutas), oxidasa cataliza la oxidación de glucosa a ácido glucónico.
Tansferasas: Catalizan la transferencia de un grupo de una sustancia a otra.
Ejemplo: la transmetilasa es una enzima que cataliza la transferencia de un
grupo metilo de una molécula a otra.
 ¿Qué tiene que ver la desnaturalización de las proteínas con esta
práctica? En que pruebas se puede evidenciar la desnaturalización de las
enzimas.
Una proteína desnaturalizada cuenta únicamente con su estructura primaria.
En algunos casos, la desnaturalización conduce a la pérdida total de la
solubilidad, con lo que la proteína precipita. La formación de agregados
fuertemente hidrofóbicos impide su renaturalización, y hacen que el proceso
sea irreversible.
La desnaturalización de las proteínas consiste en la pérdida de la estructura
tridimensional por distintos factores ambientales, como temperatura, pH o
ciertos agentes químicos. La pérdida de la estructura da como resultado la
pérdida de la función biológica asociada a esa proteína, ya sea enzimática,
estructural, transportadora, entre otras.
Se distinguen agentes físicos (calor) y químicos (detergentes, disolventes
orgánicos, pH, fuerza iónica). Como en algunos casos el fenómeno de la
desnaturalización es reversible, es posible precipitar proteínas de manera
selectiva mediante cambios en:
• La Polaridad Del Disolvente
• La Fuerza Iónica
• El pH
• La Temperatura
Al ocurrir la desnaturalización, la proteína pierde su función, por esta razón se
realizó este proceso para tener un mejor manejo de las proteínas para esperar
los resultados que queremos en esta práctica. Ya que las proteínas funcionan
óptimamente cuando se encuentran en su estado nativo.
El proceso puede o no ser irreversible. En el laboratorio, si las condiciones se
revierten puede que la proteína vuelva a su configuración inicial. Esto se vio en
la prueba de presencia de catalasa en tejidos animales y vegetales
 Mediante un diagrama explique cómo actúa la glucosidasa de las
levaduras sobre la sacarosa.
La sacarosa es un glúcido sencillo formado por la unión de glucosa y fructosa.
Cuando se rompe el enlace entre estas dos sustancias (esta reacción se llama
hidrólisis) se libera por lado glucosa y por otro, fructosa.
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 Investigue que es el pardeamiento enzimático.

El pardeamiento enzimático es el que ocurre por acción de enzimas, como por


ejemplo la polifenoloxidasa que actúa sobre sustratos como los polifenoles
produciendo las quinonas que se polimerizan para dar finalmente el color
marrón. Este proceso ocurre en algunas frutas frescas y hortalizas cuando son
peladas, golpeadas o cortadas.

En el campo de los alimentos, el pardeamiento enzimático puede ser un


problema muy serio en frutas, champiñones, patatas y otros vegetales, y
también en algunos crustáceos, e incluso en la industria del vino, al producir
alteraciones en el color que reducen el valor comercial de los productos, o
incluso los hacen inaceptables para el consumidor. Estas pérdidas son muy
importantes en el caso de las frutas tropicales y de los camarones, productos
trascendentales para la economía de muchos países poco desarrollados.
Cuando pelamos y/o troceamos frutas como la manzana o la pera, observamos
que su superficie se tiñe enseguida de un color marrón cada vez más oscuro.
Este fenómeno se debe a unas enzimas -proteínas que ejecutan reacciones
químicas- llamadas polifenoloxidasas. Éstas son muy ubicuas en la naturaleza,
encontrándose en prácticamente todos los seres vivos desde las bacterias al
hombre.
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BIOQUÍMICA

Las polifenoloxidasas de las frutas oxidan ciertos fenoles introduciendo átomos


de oxígeno en su composición. De esta manera los transforman en quinonas,
las cuales se polimerizan dando lugar a pigmentos marrones, rojos y negros.
En frutas íntegras, las polifenoloxidasas y los fenoles están en compartimentos
celulares separados (en cloroplastos, otros plástidos y citoplasma las primeras,
y en vesículas los segundos) por lo que su color no se ve alterado.

Ahora bien, cuando las frutas están “sobremaduradas” o son sometidas a


cortes u otras agresiones, las membranas de los compartimentos celulares se
destruyen. Ello permite que las polifenoloxidasas contacten con los fenoles y
con el oxígeno atmosférico. La conjunción de estos tres elementos conduce a
la formación de las quinonas y a la posterior aparición de los mencionados
pigmentos. El resultado es lo que se denomina “pardeamiento enzimático”.
Este oscurecimiento acarrea importantes pérdidas postcosecha en vegetales
(como las peras, las manzanas, los melocotones, los plátanos, las lechugas,
etc.) y hongos (como los champiñones).

 Químicamente qué es el metabisulfito de sodio y que efecto tiene sobre


las polifenol oxidasas? ¿Qué aplicaciones industriales tiene este
compuesto?
METABISULFITO DE SODIO
El metabisulfito de sodio es un compuesto químico inorgánico con fórmula
Na2S2O5. Físicamente es un polvo blanco o ligeramente cristalino. El
metabisulfito de sodio se puede preparar mediante la evaporación de una
solución de bisulfito de sodio saturado con dióxido de azufre.
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BIOQUÍMICA

EFECTO SOBRE LAS POLIFENOL OXIDASAS


Las polifenol oxidasas (PPOs) son enzimas ubicuas que catalizan la reacción
dependiente de oxígeno que transforma o-difenoles en o-quinonas. Estas
quinonas son reactivas y capaces de modificar covalentemente un amplio
abanico de especies nucleófilas, del interior de las células, que conduce a la
formación de polímeros marrones, conocido como pardeamiento enzimático.
El fenómeno de pardeamiento durante el crecimiento, recogida,
almacenamiento y procesado de frutos y vegetales, es un problema de primera
magnitud en la industria agroalimentaria y se reconoce como una de las
principales causas de pérdidas de calidad y valor comercial. Produce cambios
importantes tanto en la apariencia como en las propiedades organolépticas de
frutos y vegetales comestibles, además suele ir asociado al desprendimiento
de olores y efectos negativos sobre el valor nutricional. El metabisulfito de
sodio es un compuesto inorgánico utilizado en la industria de alimentos como
un agente conservador, antioxidante, es polivalente desde un punto de vista
tecnológico que encuentra aplicación en distintos tipos de alimentos. Entre sus
funciones más relevantes destaca su capacidad de inhibición del pardeamiento
enzimático y no enzimático, el control e inhibición del crecimiento microbiano,
la prevención del enranciamiento oxidativo y la modificación de las propiedades
reológicas de los alimentos.
Este aditivo tiene aplicaciones específicas en relación con cada efecto concreto
pero en la mayoría de los alimentos se usan con más de una finalidad.
Dada la gran reactividad del SO2, una vez adicionado a los alimentos reacciona
rápidamente con distintos constituyentes como compuestos carbonílicos,
quinonas, proteínas, vitaminas antocianos entre otros, para dar lugar a
diferentes combinaciones. Generalmente existe un equilibrio entre las formas
libres y combinadas
APLICACIONES
 En minería se utiliza para precipitar el oro a partir del ácido áurico.
 Se utiliza en la producción de cloroformo, estiren sulfonal y benzaldehído.
 En la industria de plásticos se utiliza como coagulante.
 En curtiduría se utiliza para procesar y hacer la piel más suave y a prueba
de agua.
 En la industria de los alimentos se utiliza como conservador en alimentos
horneados, mermeladas, vinos, fruta seca y salsas ya que inhibe el
crecimiento de hongos y bacterias. También se utiliza como antioxidante.
 Se utiliza como agente limpiador para potabilizar agua mediante ósmosis
inversa en sistemas de desalinización. También se utiliza para remover
cloramina para agua potable después del tratamiento.
 En farmacéutica se utiliza como excipiente para algunas tabletas.
También funciona como agente reductor en algunos medicamentos.
 Se utiliza para disolver oxígeno en el agua de desecho.
 Funciona como agente de blanqueado en la fabricación del papel y el
algodón.
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10. BIBLIOGRAFIA
PARDEAMIENTO ENZIMATICO
http://datateca.unad.edu.co/contenidos/301203/301203/leccin_38_pardeamiento_enzi
matico.html 05/07/2014
http://www.bionova.org.es/biocast/tema14.htm
https://www.lifeder.com/desnaturalizacion-proteinas/#Consecuencias
https://frutayciencia.wordpress.com/tag/polifenoloxidasa/

11. ANEXOS

Tabla 1. Acción de la catalasa

Muestra Reacción con el H2O2

Hígado hervido

Hígado sin hervir

Zanahoria hervida

Zanahoria sin hervir

Fuente: Laboratorio de Medio Ambiente


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BIOQUÍMICA

Tabla 2. Hidrólisis del almidón

Tubo Lugol Felhing

1-3

Figura 1 Figura 2
No existen cambios mas Se observo parte de la mezcla
que el color de color blanquezina,
transparente
2-4

Figura 3
Figura 4
No existen cambios mas
Se observo parte de la mezcla
que el color
de color blanquezina,
transparente
Fuente: Laboratorio de Medio Ambiente
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Tabla3: Hidrólisis de la sacarosa

Tubo

1 5 mL de agua y Fehling

Figura 5
Variaciones en color bbniozs xs xs

2 5 mL de agua más 3 mL de extracto de


levadura y Fehling

Figura 6
No se lograron unir las mezclas

Fuente: Laboratorio de Medio Ambiente


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Tabla 4: Acción de las polifenol-oxidasas

Caja Petri Metabisulfito Sódico

1 Sin hervir

Figura 7
Presenta pequeñas coloraciones
marrones

2 Hervido

Figura 8
No presenta cambios
Fuente: Laboratorio de Medio Ambiente

Grupo 2 Hidrolisis de almidon por acción de la amilasa

Fuente: Laboratorio de Medio Ambiente

Figura 9 Figura 10 Figura 11


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BIOQUÍMICA

Figura 12 Figura 13

Grupo 3 Hidrolisis de la sacarosa por glusidasa

Fuente: Laboratorio de Medio Ambiente

Figura 14 Figura 16
Figura 15

Figura 17 Figura 18