DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA 502507

CONSTITUYENTES DE LA LECHE

I. EL PROBLEMA
Identificar, mediante ensayos químicos cualitativos, los principales biocompeustos presentes en la leche, asi como
identificar algunos factores que afectan la estabiliad de las proteínas y que permiten su aislamiento.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

La leche constituye uno de los alimentos más ricos en nutrientes puesto que es el único alimento de los mamíferos recién
nacidos durante un período variable según la especie.

Entre los principales biocompuestos que se encuentran presentes están las proteínas tanto solubles en el suero, por
ejemplo, la lacto-albúmina y proteínas emulsificadas como la caseína que es rica en grupos fosfato. Igualmente dentro de
los carbohidratos está el disacárido lactosa, conocido como azúcar de la leche. También es rica en grasas, vitaminas y
minerales. Este alimento es ideal para el lactante y solo presenta deficiencias en hierro y vitamina C.

La composición química de la leche varía en las distintas especies y dentro de las mismas según los períodos de lactancia,
la dieta ingerida y secreción hormonal.

DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS

La desnaturalización consiste en el desdoblamiento total o parcial de la conformación nativa de una cadena

polipeptídica o una proteína. Consiste en romper las fuerzas que estabilizan la estructura secundaria, es decir, los puentes
de hidrógeno entre enlaces peptídicos y/o terciaria o cuaternaria, como las fuerzas esquematizadas en la figura 1.

FIGURA 1

1) Puentes disulfuro. 3) Puente de hidrógeno.

2) Puente salino o interacción electrostática. 4) Interacción hidrofóbica.

Las proteínas tal como se encuentran dentro de las células o en los fluidos corporales, tienen una conformación nativa y se
encuentran solubilizadas en soluciones coloidales o suspensiones coloidales, si se producen ciertas alteraciones en las
condiciones del medio acuso las proteínas se desdoblan pierden solubilidad y precipitan o coagulan.
Diversos agentes desnaturalizantes pueden inducir estas alteraciones como la agitación, el cambio de temperatura, la
adición de sustancias ácidas o básicas, sales, metales pesados, reactivos con grupos tiol, solventes orgánicos, etc.
La desnaturalización es un propiedad selectiva de gran utilidad durante los procesos de aislamiento y purificación de
proteínas, ya que no todas la proteínas reaccionan de igual forma ante un cambio en el medio donde se encuentra disuelta.

III. MATERIAL EQUIPOS Y REACTIVOS

Material biológico:
Leche entera cruda de vaca o de cabra, según le corresponda.
Material y equipo de laboratorio, de uso general

Balanza con precisión de décima de gramo

Gasa o muselina y papel de filtro
Lámpara de luz ultravioleta
6 potenciómetros
Centrífugas
Papel indicador universal

Material por grupo de trabajo

20 tubos de ensayo- gradilla 1 pipeteador

1 vaso de precipitados de 250 mL 1 pinza para tubo
2 vasos de precipitados de 150 mL 1 microespátula
2 pipetas graduadas de 5 mL 4 goteros plásticos
1 embudo de vidrio mediano 1 aro con nuez
1 erlenmeyer de 150 mL 4 tubos de centrífuga
1 placa de calentamiento

1 vaso de precipitados de 400mL

Reactivos
Ácido clorhídrico 10% (200 mL)
Acido nítrico concentrado (200 mL)
Acido sulfúrico concentrado ( 50mL)
Acetato de plomo 0,1M (500 mL)
Hidróxido de sodio 40% (300 mL)
Hidróxido de sodio 1% (300 mL)
Hidróxido de sodio 10% (300 mL)
Hidróxido de sodio al 20% (300 mL)
Carbonato de calcio sólido ( 20g)
Reactivo de Biuret (500 mL)
Reactivo de Benedict (200 mL)
KCl sólido
Alcohol isobutílico
Solución de oxalato de amonio al 4%
Ferrocianuro de potasio 1%
Reactivo de Hopkins Cole FRESCO: ácido acético impurificado con trazas de ácido glioxílico(100ml).

IV. PROCEDIMIENTO

1.Tratamiento preliminar de la muestra

Colocar en un vaso de precipitados 50 mL de leche y 50 mL de agua destilada, añadir gota a gota y con agitación suave
ácido clorhídrico al 10 % hasta que se observe que la leche se “corta” (formación de un precipitado floculento). Controlar
con papel indicador universal o con el potenciómetro que el pH de la mezcla no sea menor de 4,0 ni mayor de 5,0, si hay
un exceso de ácido, adicionar NaOH al 1% gota a gota y con agitación suave, hasta ajustar el pH. Dejar en reposo por
unos minutos, filtre sobre un pedazo de gasa o de muselina y luego si es necesario realice una segunda filtración sobre
papel filtro, separe el precipitado del filtrado.

Divida el filtrado en tres fracciones de aproximadamente 10mL cada una (fracciones A y B y C)

2. Identificación de proteína y vitaminas

De la fracción A tome en un tubo de ensayo 5mL y adicione 1 gramo de carbonato de calcio, calentar en un baño maría a
ebullición, dejar en reposo hasta que precipite, centrifugar y reservar el sobrenadante para las pruebas de vitaminas. Sobre
el precipitado adicione 20 gotas del reactivo de Biuret. Observar.

Con el sobrenadante que reservó realice los ensayos de reconocimiento de otras proteínas y vitaminas:

2.1. Identificación de tiamina

A 5 mL de la fracción A del filtrado en un tubo de centrifuga, añadir aproximadamente 0,3 g de KCl, 1 mL de

ferrocianuro de potasio 1% y 1,5 mL de NaOH al 10%. Mezclar y disolver completamente el KCl. Añadir 5 mL de
alcohol isobutílico, agitar por 2 minutos cuidadosamente y centrifugar por 2 minutos a 2000 rpm. Colocar el tubo en la
fuente de luz ultravioleta y observar la fluorescencia en la capa alcohólica, la cual será proporcional a la concentración de
tiamina.

2.2 Reconocimiento de riboflavina

En un tubo de ensayo colocar 1 mL de la fracción A del filtrado (debe estar bien transparente o claro) y observar a la luz
ultravioleta, la fluorescencia indica la presencia de riboflavina.

2.3Identificación de proteínas

Para la fracción B del filtrado caliente en un baño maría a ebullición máximo por 10 minutos y ; al formarse un
precipitado deje en reposo hasta que se decante, centrifugue y elimine el sobrenadante. Sobre el precipitado adicione 20
gotas del reactivo de Biuret, mezcle y observe.

Para el ensayo de proteínas sobre la fracción sólida retenida en la gasa, tome una pequeña cantidad del sólido colóquela
en tubo de ensayo adicione 20 gotas del reactivo de Biuret, mezcle y observe.

3.Identificación de minerales

Realice la siguiente prueba utilizando la fracción C del filtrado.

3.1Reconocimiento de calcio

Colocar en un tubo de ensayo 3 mL del filtrado C y adicionar 1 mL de oxalato de amonio al 4%, centrifugue, si es
necesario y observe la formación de un precipitado blanco de oxalato de calcio.

4.Reconocimiento de carbohidratos

En un tubo de ensayo colocar 3 mL del filtrado C, sí el pH no es básico ajustarlo a pH 8 y adicionar 1 mL de reactivo de

Benedict, agitar y colocar al baño maría en ebullición; observar la formación de un precipitado.

5.Reconocimiento de aminoácidos

5.1.Reacción con acetato de Plomo alcalino

En un tubo de ensayo coloque 3mL del filtrado C y en otro tubo una pequeña fracción del sólido retenido en la gasa,
adicione 2 mL de solución de NaOH al 20% y luego 20 gotas de solución de acetato de plomo 0,1 M. Caliente los tubos
al baño maría en ebullición por 5 minutos y observe. La formación de un precipitado gris oscuro, café o negro es prueba
positiva para aminoácidos azufrados como la cisteína

5.2.Reacción xantoproteíca
En un tubo de ensayo coloque 3mL del filtrado C y en otro tubo una pequeña fracción del sólido retenido en la gasa,
adicione 1 mL de HNO3 concentrado y caliente al baño maría. Luego enfríe en un baño con agua –hielo y adicione gota a
gota una solución de NaOH al 40% agitando cuidadosamente y en frío. El color amarillo que vira a naranja es prueba
positiva para Tirosina y Triptófano.

5.3Reacción de Hopkins Cole

En un tubo de ensayo coloque 3mL del filtrado C y en otro tubo una pequeña fracción del sólido retenido en la gasa.
Adicione 2 ml del reactivo de Hopkins Cole. Mezcle bien el contenido y adicione a cada tubo por las paredes lenta y
cuidadosamente, sin mezclar 1 mL de ácido sulfúrico concentrado, la formación de un anillo violeta en la interfase es
prueba positiva para el triptófano.

V. BIBLIOGRAFÍA.

Berg, J.; Tymozco, J. y Stryer, L. (2008). Bioquímica. 8 ed. España: Reverté.

Cheftel, J. C. (1986). Proteínas alimentarias. España: Acribia,

Plummer, D. Bioquímica Práctica. (1981). México: McGraw Hill Latinoamericana.

Rendina, G. (1974).Técnicas de Bioquímica aplicada. México: Interamericana.

Laboratorio de Bioquímica, Prácticas para la carrera de Biología. (1995).

Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias, Departamento de Química, Bogotá.
 PREINFORME / CONSTITUYENTES DE LA LECHE

Nombre_____________________________________________ Grupo____

Recuerde que se le realizará un quiz en papel individual sobre todo el contenido del preinforme.
1.Consulta

1.Tabla con composición promedio de la muestra de leche en carbohidratos, lípidos, proteínas, aminoácidos, vitaminas y
calcio. (recuerde colocar unidades de concentración).

2.Tabla de composición promedio con nombres de proteínas y aminoácidos de las diferentes fracciones de la leche (suero
y caseínas), recuerde colocar unidades de concentración.

3.Consulte el o los nombres de la(s) proteína(s) que se puede(n) desnaturalizar al colocar la leche entera a pH de entre 4-5
y relacione este procedimiento con la precipitación isoeléctrica.

4.Consulte el o los nombres de la(s) proteína(s) del suero de la leche que se puede(n) desnaturalizar al calentar hasta
ebullición.

5.Consulte el o los nombres de la(s) proteína(s) del suero de la leche que se puede(n) desnaturalizar al agregar carbonato
de calcio.

2. Fichas técnicas
Propiedades de los reactivos a usar en el laboratorio
Nombre Fórmula Aspecto Peligrosidad* Primeros auxilios Desechos
(ácidos, básicos,
orgánicos o metales
pesados)
*
Indique la peligrosidad con el símbolo correspondiente: explosivo (E), comburente (O), inflamable (F), extremadamente
inflamable (F+), tóxico (T), muy tóxico (T+), corrosivo (C), nocivo (Xn), irritante (Xi) y/o peligroso para el medio
ambiente (N).

3. Bibliografía (normas APA)

4.Procedimiento en diagrama de flujo y resultado esperado para cada prueba:

4.1 Identificación de proteínas en la fracción A

4.2 Identificación de proteínas en la fracción B

4.3 Identificación de proteínas en sólido retenido en la gasa

4.4 Identificación de tiamina

4.5 Identificación de riboflavina

4.6 Identificación de calcio

4.6 Identificación de carbohidrato

4.7 Reacción con acetato de Plomo alcalino

4.8 Reacción xantoproteíca

4.9 Reacción de Hopkins Cole

Pautas para resultado esperado de desnaturalización y separación de proteínas.

*Recuerde revisar las diapositivas de desnaturalización revisadas en clase de la complementaria.
1) Agente desnaturalizante a usar
2) Efecto del agente desnaturalizante sobre la estructura de la proteína
3) Nombres de proteína(s) que podrá separar de acuerdo con la consulta.
4) Observación

Pautas para resultado esperado de aminoácidos, minerales, carbohidratos, vitaminas

1)Nombre de moléculas a reconocer y valores de concentración de estas (consultados para la leche
particular a usar).
2)Fundamento químico ( reactivo de reconocimiento si aplica, tipo de reacción)
3) Observación

INFORME
__________________________________________________________________________________________

Recuerde que un factor de éxito para elaborar el informe es usar la información de su preinforme (consulta,
procedimientos y resultados esperados) para explicar y no describir, emplear citas que correspondan con la
bibliografía, e interpretar tanto las pruebas positivas como las negativas.
El informe debe contener:
1.-Tablas de observaciones, aclarando a la fracción de leche usada (A,B,C ó sólido en gasa) describiendo en cada caso si
la prueba fue positiva o negativa y las fotos con tubos debidamente marcados, no anoté tubo 1,2,3,etc sino todo lo que
adicionó en este.

2-En la discusión de resultados incluya:

-El análisis de los procesos de desnaturalización realizados sobre la leche y sus fracciones con los pasos correspondientes
a la adición de ácido clorhídrico, carbonato de calcio y calentamiento a ebullición, relacionándolos con factores
desnaturalizantes como pH y punto isoeléctrico, sales y temperatura, así como con su efecto en la estructura e
interacciones de las proteínas.
-Mencione brevemente los pasos para elaborar queso crema para untar(con vinagre) y un postre de natas, y cómo se
relacionan con los procedimientos de la guía arriba explicados.
-Los nombres de las posibles proteínas aisladas por la desnaturalización y la ecuación de la reacción de reconocimiento de
Biuret y su explicación con base en el fundamento químico.
-La relación con las tablas de composición de la leche.

Para cada prueba de reconocimiento de vitaminas incluya:

-Las estructuras desarrolladas de las vitaminas y la relación de estas con la propiedad de la fluorescencia directa o de los
derivados generados(tiocromo).
-La relación con las tablas de composición de la leche.

Para la prueba de reconocimiento de carbohidrato incluya:

-La ecuación de la reacción correspondiente con fórmulas desarrolladas, la explicación del fundamento químico de la
prueba y la relación con las tablas de composición.

Para la prueba de reconocimiento de calcio incluya:

-La ecuación de la reacción correspondiente con fórmulas desarrolladas, la explicación del fundamento químico de la
prueba y la relación con las tablas de composición.

Para cada prueba de reconocimiento de aminoácidos incluya:

-El o los grupos funcionales que reaccionaron o los responsables de la coloración positiva del ensayo, use imagenes de
fórmulas estructurales desarrolladas.
-La ecuación química correspondiente con el o los aminoácidos particulares que pudo identificar, la relación con el
fundamento químico y tablas de composición de aminoácidos.

3.-Conclusiones: redacte una conclusión para cada prueba afirmando los resultados obtenidos, explicando brevemente el
procedimiento y las posibles incertidumbres o errores, todo con base en la discusión de resultados.

4. Redacte la bibliografía correspondiente en normas APA.