UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERÍA

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA Y TEXTIL

Departamento Académico de Ingeniería Química

Laboratorio de Bioquímica y Microbiología

PI-721/A

Medios de cultivo: Bacterias y hongos

Realizado por Grupo 3:

Profesora responsable de la práctica:

PhD. Jessica Nieto

Periodo académico: 2021-1

Fecha: 30 de junio de 2021

Tabla de contenido

Medios de cultivo: Bacterias y hongos ........................................................................................... 1

Fundamento teórico ..................................................................................................................... 1

Diagrama de flujo ........................................................................................................................ 3

Materiales, equipos y reactivos ................................................................................................... 4

Seguridad en el laboratorio ......................................................................................................... 5

Resultados esperados................................................................................................................... 5

Referencias bibliográficas ............................................................................................................. 16

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Medios de cultivo: Bacterias y hongos

Fundamento teórico

Un medio de cultivos es una preparación líquida o sólida que se emplea para el

crecimiento, transporte, o mantenimiento de microorganismos. La composición de un medio

adecuado para un microrganismo depende de sus necesidades nutricionales.

Medios definidos y medios complejos

Los medios definidos son aquellos de los que se conocen todos sus componentes.

Frecuentemente, se emplean en investigación, pues a menudo se quiere conocer qué está

metabolizando el microorganismo experimental.

Los medios complejos son aquellos que contienen algunos ingredientes cuya composición

química exacta se desconoce. Un único medio complejo puede ser suficiente para satisfacer las

necesidades nutricionales de diversos microorganismos, lo cual es de gran utilidad porque, a

menudo, las necesidades nutricionales de un microorganismo son desconocidos.

Si se requiere un medio sólido, se puede solidificar un medio líquido añadiendo agar al

1.5%. El agar es un buen medio solidificante porque una vez fundido en agua hirviendo, pueden

enfriarse hasta 40 °C sin endurecerse y no fundirá de nuevo hasta alcanzar una temperatura de 80

°C; además, la mayoría de los microrganismos no pueden degradarlo.

Tipos de medios

Los medios para fines generales son aquellos que mantienen el crecimiento de muchos

microrganismos.
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Los medios selectivos favorecen el crecimiento de microrganismos particulares, pero

inhiben el crecimiento de otros.

Los medios diferenciales permiten discriminar entre grupos distintos de bacterias

mediante cambios observables (p. ej. cambio en el color o cambio en el pH).

Los medios enriquecidos permiten el crecimiento de un organismo en particular que

podría no estar presente en la cantidad necesaria para ser aislado e identificado. A diferencia de

un medio selectivo, el medio enriquecido no inhibe otros microrganismos.

Siembra en placa por extensión y en estrías

En la siembra por extensión, se pasa un volumen pequeño de una mezcla microbiana al

centro de una placa de agar y se extiende de manera uniforme con una varilla de vidrio estéril.

Las células diseminadas sobre la superficie desarrollarán colonias aisladas.

En la siembra por estrías, se inocula la mezcla microbiana sobre un extremo de la placa

de agar con un asa de siembra y se extiende formado estrías sobre la superficie en varios

sentidos. Las células individuales se desprenden del asa al frotarla sobre la superficie y

desarrollan colonias aisladas.

En la siembra en profundidad, la muestra original se diluye varias veces para reducir la

población microbiana lo suficiente y obtener colonias separadas cuando siembren. Luego, se

mezclan volúmenes pequeños de las muestras diluidas con agar líquido (~45°C) y la mezcla se

vierte en placas de cultivo estériles. Una vez que el agar endurece, cada célula forma una colonia

individual. Debido a razones estadísticas y de fiabilidad, el conteo se realiza únicamente en

aquellas placas que contienen entre 30 y 300 colonias. El número total de colonias equivale al

número de microorganismos viables en la muestra diluida.

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Diagrama de flujo

Pesado del medio

Agregar agua Homogenizar la
y agregar al Añadir el agar
destilada mezcla
matraz

Tapar los
Repartir el medio matraces con Esterilizar en
Dejar enfriar
líquido en otros algodón graso y autoclave
hasta 50°C
matraces recubrir con (121°C, 15 min.)
papel aluminio

Trabajar en
Mantener las
condiciones Verter el medio Dejar enfriar
placas en
asépticas de cultivo a la hasta que
posición
(mechero de placa de Petri solidifique
invertida
Bunsen)
Figura 1. Preparación de medios de cultivo

Destapar el recipipente
Flamear el asa de Introducir el asa y tomar
de la muestra y flamear
siembra el inóculo
la boca

Poner la placa Petri en

Flamera la boca del forma invertida en la
Realizar la siembra por incubadora
recipiente, taparlo y
estrías
guardarlo • Bacterias: 37°C, 24 hrs
• Hongos: 28°C, 10 días
Figura 2. Siembra de microrganismo en placa
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Materiales, equipos y reactivos

Placa Petri Matraz de Erlenmeyer Mechero Bunsen

Cinta de autoclave Papel aluminio Incubadora

Balanza de precisión Autoclave Agar

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Seguridad en el laboratorio

• Usar la indumentaria adecuada, es decir, guardapolvo, guantes y gafas.

• Trabajar en condiciones asépticas (cercanía al mechero).

• Evitar el contacto con la muestra de bacterias y hongos, a fin de reducir el riesgo de

propagación de microorganismos

• Finalizada la esterilización en autoclave, no abrir la tapa superior hasta que el manómetro

esté a cero y la válvula de vapor abierta.

Resultados esperados

Bacteria: Bifidobacterium

Medio de cultivo

Dado que el hábitat natural de las bacterias del género Bifidobacterium es el tracto

intestinal de animales, estas requieren condiciones anaerobias y una composición compleja para

su desarrollo. De acuerdo con Barrett et al. (2012), un medio empleado con frecuencia para el

cultivo de bifidobacterias, cuya preparación no requiere suplementos de sangre u otros

componentes difíciles de preparar y que, además, permite el crecimiento de bifidobacterias de

todos los hábitats conocidos es el de triptona-fitona-extracto de levadura (TPY); otros medios

son el agar De Man, Rogosa y Sharpe modificado con cisteína (cys-MRS) y el agar clostridial

reforzado (RCA). El medio de TPY comercializado por Condalab tiene la composición mostrada

en la tabla 1. La triptona y el digerido papaínico de soya proporcionan nitrógeno, vitaminas,

minerales y aminoácidos necesarios para el crecimiento; el extracto de levadura es una fuente de

vitaminas (particularmente, del grupo B); el MgCl2, ZnSO4, CaCl2 y FeCl3 permiten la detección

de bifidobacterias dañadas o en pequeñas cantidades y mejora su crecimiento; el fosfato de

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potasio actúa como sistema tampón y el clorhidrato de L-cisteína cumple la función de agente

reductor.

Tabla 1

Composición del medio de cultivo de triptona-fitona-extracto de levadura

Componente Concentración (g/L)

Dextrosa 15

Fosfato dipotásico 2

Cloruro de magnesio anhidro 0,5

Triptona 10

Sulfato de zinc 0,25

Cloruro de calcio 0,15

Cloruro férrico 0,01

Digerico papaínico de soya 5

Extracto de levadura 2,5

L-cisteína 0,5

Tomado de TPY Broth. Selective medium for the isolation of Bifidobacterium, Condalab, 2019.

https://www.condalab.com/int/en/dehydrated-culture-media/1243-8117-tpy-broth.html

La preparación, como indica la ficha técnica del producto, se realiza de la siguiente

manera: En primer lugar, se suspende 36 gramos del medio en un litro de agua destilada, se

mezcla bien y se disuelve por calentamiento con agitación frecuente. Luego se hierve por un

minuto hasta disolución completa. Finalmente, se dispersa en un contenedor apropiado y se

esteriliza en autoclave a 121 °C por 15 minutos. El medio puede hacerse más selectivo añadiendo
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3 gramos de cloruro de litio, 0,1 g de sulfato de neomicina y 0,015 gramos de ácido nalidíxico

por litro de medio.

Debe tenerse en cuenta que para la cuantificación efectiva de colonias de Bifidobacterium

en muestras provenientes de hábitats naturales o productos lácteos fermentados es necesario un

medio selectivo frente a géneros como Lactobacillus y Lactococcus. Según Barrett et al. (2012),

para el caso de hábitats naturales, se encuentra comprobada la utilidad del medio de Wilkins-

Chagren con mupirocina (100 mg/L) y ácido acético (1 mL/L) añadido (medio MW) en muestras

obtenidas del ciego de conejos y gallinas, ya que no se observó inhibición en seis especies de

Bifidobacterium (incluyendo los probióticos B. bifidum y B. longum), pero sí en nueve especies

de Lactobacillus; por otro lado, para el caso de productos lácteos, un estándar desarollado en

conjunto por la Federación Internacional de Productos Lácteos (IDF) y la Organización

Internacional de Normalización (ISO) se emplea agar de propionato de oligosacárido trans-

galactosilado (TOS), que permite el crecimiento de todas las especies de bifidobacterias

empleadas en productos lácteos fermentados, con excepción de algunas cepas de B. bifidum. La

composición del agar propionato TOS comercializado por Condalab se muestra en la tabla 2.

Tabla 2

Composición del medio de cultivo agar propionato TOS

Componente Concentración (g/L)

Sulfato de amonio 3

Peptona de caseína 10

Galactooligosacárido TOS 10

Sulfato de magnesio heptahidratado 0,2

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Propionato de sodio 15

Agar bacteriológico 15

Fosfato dipotásico 4,8

Clorhidrato de L-cisteína 0,5

Fosfato monopotásico 3

Extracto de levadura 1

Tomado de TOS Propionate Agar Base ISO, Condalab, 2020.

https://www.condalab.com/int/es/medios-de-cultivo-deshidratados/1273-9673-base-de-agar-

propionato-tos-iso.html

La preparación, como indica la ficha técnica del producto, se realiza de la siguiente

manera: En primer lugar, se suspende 62,5 gramos del medio en 990 mL de agua destilada, se

mezcla bien y se disuelve por calentamiento con agitación frecuente. Luego se esteriliza en

autoclave a 115+3 °C por 15 minutos (ya que el medio es sensible al calor, se recomienda

emplear pequeñas cantidades, 95-190 mL, en la autoclave), se enfría en un baño de agua y, si se

desea, se añade (asépticamente) un suplemento selectivo (MUP Selective Supplement).

Finalmente, se homogeneiza el medio y se dispensa en contenedores estériles.

Técnica de siembra

Para la inoculación se puede emplear el método de siembra de estría en placa, tal como se

indica en el apartado correspondiente a la especie fúngica elegida.

Imágenes
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Figura 3. Bifidobacterium spp. en agar de extracto TPY. (A): B. bifidum NC1MB 700795

incubado anaeróbicamente a 37 °C por 72 h. (B): B. breve YIT 4052 (flecha negra) y

Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus CH1 (flecha blanca) incubado anaeróbicamente a 37

°C por 72 h. Tomado de Culture media for the detection and enumeration of bifidobacteria in

food production, por E. Barrett et al. en J. E. L. Corry, G. D. W. Curtis y R. M. Baird (Eds.),

Handbook of culture media for food and water microbiology (3a ed.), p. 203, 2012, Royal

Society of Chemistry.

Figura 4. Bifidobacterium spp. en agar cys-MRS. (A): B. breve YIT 4052 incubado

anaeróbicamente a 37 °C por 72 h. (B): B. adolescentis NCIMB 702230 (flecha negra) y

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Lactococcus lactis DRC3 (flecha blanca) incubado anaeróbicamente a 37 °C por 72 h. Tomado

de Culture media for the detection and enumeration of bifidobacteria in food production, por E.

Barrett et al. en J. E. L. Corry, G. D. W. Curtis y R. M. Baird (Eds.), Handbook of culture media

for food and water microbiology (3a ed.), p. 204, 2012, Royal Society of Chemistry.

Figura 5. Bifidobacterium spp. en RCA. (A): B. adolescentis NCIMB 702230 incubado

anaeróbicamente a 37 °C por 72 h. (B): B. longum NCIMB 708809 (flecha negra) y

Lactobacillus johnsonii DSM 10533 (flecha blanca) incubado anaeróbicamente a 37 °C por 72 h.

Tomado de Culture media for the detection and enumeration of bifidobacteria in food

production, por E. Barrett et al. en J. E. L. Corry, G. D. W. Curtis y R. M. Baird (Eds.),

Handbook of culture media for food and water microbiology (3a ed.), p. 204, 2012, Royal

Society of Chemistry.
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Figura 6. Bifidobacterium spp. en agar propionato TOS. (A): B. breve YIT 4052 incubado

anaeróbicamente a 37 °C por 72 h. (B): B. adolescentis NCIMB 702230 (flecha negra) y

Lactococcus lactis DRC3 (flecha blanca) incubado anaeróbicamente a 37 °C por 72 h. Tomado

de Culture media for the detection and enumeration of bifidobacteria in food production, por E.

Barrett et al. en J. E. L. Corry, G. D. W. Curtis y R. M. Baird (Eds.), Handbook of culture media

for food and water microbiology (3a ed.), p. 214, 2012, Royal Society of Chemistry.

Aplicación

Las especies de Bifidobacterium se encuentran de forma natural como parte de la

microbiota intestinal de mamíferos y aves, en una proporción de alrededor del 4% (Barrett et al,

2012). Además, se encuentran como probióticos en productos lácteos fermentados como el yogur

y el queso.
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Hongo: Saccharomyces cerevisiae

Medio de cultivo

El agar papa dextrosa es un medio altamente nutritivo que favorece el crecimiento de

hongos y levaduras, es decir, sirve para aislar todo tipo de hongos entre los cuales se encuentra la

Saccharomyces cerevisiae. La composición de este medio de cultivo se presenta en la tabla 3.

Tabla 3

Composición del medio de cultivo de agar papa dextrosa

Componente Concentración (g/L)

Extracto de papa 4

Dextrosa 20

Agar 15

Tomado de Medios de cultivo Bacteriología general, DIBICO. http://www.probiotek.com/wp-

content/uploads/2014/01/1059-E_AGAR-DEXTROSA-Y-PAPA.pdf

Para su preparación se disuelve 39 g del medio en 1 litro de agua destilada. Se calienta

agitando frecuentemente hasta el punto de ebullición y mantenerlo durante 1 minuto para su

disolución completa. Se esteriliza en autoclave a 120 ºC durante 15 minutos y finalmente se

enfría aproximadamente a 45 °C para vaciar en las placas Petri estériles para su solidificación.

Cuando se utiliza este medio para el recuento de hongos y levaduras, agregar al medio de

cultivo una vez esterilizado y enfriado aproximadamente a 45ºC, 14 ml de una solución estéril de

ácido tartárico al 10% para obtener un pH aproximado de 3.5. esto se realiza con la finalidad de

poder inhibir el crecimiento bacteriano.

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El almacenamiento de este medio de cultivo se debe de realizar con la tapa de la placa

hacia abajo y para evitar las condensaciones de agua se recomienda evitar los cambios bruscos

de temperatura, por lo que su almacenamiento debe de estar entre 4 – 10 °C

Técnica de siembra

Para la inoculación de este hongo se utiliza la técnica de siembra por estría en placa

Este método es simple y el más usado para obtener cultivos axénicos. Para ello, con un asa de

siembra se toma una muestra y se hacen estrías sobre la superficie del cultivo preparado en una

placa Petri. Conforme se van haciendo estrías en zigzag con el asa, cada vez se van depositando

en la superficie del medio menos microorganismos. Cada vez que la muestra del asa se termine

se flamea el asa, se toma más muestra se toca en la región donde se han realizado las últimas

estrías y se continúa la siembra con la misma técnica.

Repitiendo este proceso varias veces se logra separar células individuales. A

continuación, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que las células aisladas

experimenten un número suficiente de divisiones para desarrollarse.

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Figura 7. Técnica de inoculación por estría en placa

Figura 8. Crecimiento de Saccharomyces cerevisiae en medio control Agar papa dextrosa

después de 48 horas. Tomado de Medios de cultivo a partir de residuos agroindustriales sólidos

para el crecimiento de la levadura saccharomyces cerevisiae.

Aplicación

Las levaduras del género Saccharomyces (ascomicetos) se usan para producir vino,

cerveza y otras bebidas fermentadas. El vino se produce cuando las levaduras fermentan

fructosa, y la cerveza resulta cuando las levaduras fermentan azúcar derivada del almidón en los
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granos (por lo general cebada). Saccharomyces cerevisiae, conocida como levadura del

panadero, se usa para preparar pan, pizza y otros productos de trigo. Durante el proceso de

elaboración del pan, el dióxido de carbono producido por la levadura queda atrapado en la masa

como burbujas, lo que hace que la masa “suba”; esto otorga al pan con levadura su calidad ligera.

Tanto el dióxido de carbono como el alcohol producido por la levadura escapan durante la

cocción.
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Referencias bibliográficas

Barrett, E., Mattarelli, P., Simpson, P. J., O’Toole, P. W., Fitzgerald, G. F., Ross, R. P. y

Stanton, C. (2012). Culture media for the detection and enumeration of bifidobacteria in

food production en J. E. L. Corry, G. D. W. Curtis y R. M. Baird (Eds.), Handbook of

culture media for food and water microbiology (3a ed., pp. 199–227). Royal Society of

Chemistry. https://doi.org/10.1039/9781847551450-00199

Black, J. (2008). Microbiology: principles and explorations (7a ed.). Hoboken, NJ, United States

of America: John Wiley & Sons, Inc.

Condalab (2019). TPY Broth. Selective medium for the isolation of Bifidobacterium. Obtenido de

https://www.condalab.com/int/en/dehydrated-culture-media/1243-8117-tpy-broth.html el

28 de junio de 2021.

Condalab (2020). TOS Propionate Agar Base ISO. Obtenido de https://www.condalab.com/int/

es/medios-de-cultivo-deshidratados/1273-9673-base-de-agar-propionato-tos-iso.html el

28 de junio de 2021.

DIBICO (2019). Medios de cultivo Bacteriología general. Obtenido de http://www.probiotek.

com/wp- content/uploads/2014/01/1059-E_AGAR-DEXTROSA-Y-PAPA.pdf

Polo, N., Ramírez, S. y Álvarez, A. (2017) Medios de cultivo a partir de residuos

agroindustriales sólidos para el crecimiento de la levadura saccharomyces cerevisiae.

Prescott, L., Harley, J. y Klein, D. (2004). Microbiología (5a ed.). España: McGraw-Hill

Interamericana de España.