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PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO, MÉTODOS DE AISLAMIENTO Y

SIEMBRA

Castellanos Rendon Estefanía (1929337)

Escobar Ramírez Valentina (1927361)

Rivera Álvarez Camila Andrea (1923272)

Torres Moreno Juan David (1926437)

Laboratorio de microbiología

Dr. Cristina Ramírez Toro

Universidad Del Valle

Escuela De Ingeniería De Alimentos

Santiago de Cali

21 de abril de 2021
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Tabla de contenido

Lista de figuras

Resumen

1. Introducción

2. Objetivos

2.1 Objetivo general

2.2 Objetivos específicos

3. Materiales y métodos

3.1 Preparación de medios de cultivo

3.1.1 Agar nutritivo

3.1.2 Caldo nutritivo

3.2 Siembra en tubo

3.3 Siembra en la caja de Petri

3.4 Prueba de motilidad en agar

3.5 Aislamiento por superficie

3.6 Aislamiento en profundidad

4. Resultados

4.1 Medios de cultivo

4.2 Métodos de aislamiento

4.3 Métodos de siembra

5. Discusión

6. Conclusión

7. Cuestionario

8. Referencias
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Lista de figuras

Figura 1. Medios de cultivos líquidos. A) Caldo lactosado. B) Caldo brilla. C) Caldo salmosyst

Figura 2. Medios de cultivo sólidos. A) Agar SS. B) Agar Baird Parker. C) Agar sangre.

D)Agares LIA , TDI y citrato en forma inclinada

Figura 3. Medios de cultivo semisólidos. A) Observación de crecimiento bacteriano en todo el

medio (móvil). B) Observación de crecimiento bacteriano solo en la línea de inoculación

(inmóvil).

Figura 4. Aislamiento por diseminación en un medio sólido en placa Petri. a) Continua. b) Dos

fases. c) Tres fases. d) Cuatro fases.

Figura 5. Aislamiento en placa por dilución sucesiva. a) y b) .

Figura 6. Método de siembra en tubos. a) Siembra por estría en medio inclinado. b) Siembra por

picadura. c) Siembra por picadura y estría.

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Resumen

Con el propósito de ampliar el conocimiento se realizó la investigación correspondiente sobre

algunos los medios de cultivos, los métodos de aislamiento y de siembra. Sobre los medios de

cultivo se analizaron algunos en medio liquido como el caldo lactosado y caldo brillla, además

por parte de los medios semisólidos se observo el comportamiento de los microorganismos

inoculados en él, así mismo, para los medios solidos se analizaron algunos de ellos como el agar

SS, agar sangre y demás. Estos distintos medios ayudan a las diferentes inoculaciones de

microorganismo dependiendo de sus necesidades. Para ello, es necesario una buena práctica de

inoculación como lo son el método de estrías o de picadura, dependiendo del medio. De igual

manera, para los métodos de aislamiento se ilustra la disminución de microorganismos en forma

continua o en fase, en inmersión y por medio de la dilución sucesiva de los mismos.

Palabras claves: Medios de cultivo, aislamiento, estrías e inoculación.

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Introducción

La identificación de una bacteria consiste en determinar la especie a la que pertenece y, en

algunos casos, el serogrupo e incluso la cepa. Es por ello que la primera fase, y quizá la

fundamental para la identificación de una bacteria, es la obtención de un cultivo puro utilizando

las técnicas de aislamiento. Una vez obtenido un cultivo puro, habitualmente se determina

morfología y agregación (coco, bacilo, cadenas, racimos, etc.), efectuando una tinción de Gram.

Estos datos permiten encuadrar la bacteria en alguno de los grandes grupos, como cocos Gram

positivos, bacilos Gram negativos, etc. A partir de este punto, se valoran las características de

crecimiento, lo que se efectúa sembrando la bacteria en diversos medios de cultivo y en distintas

condiciones de incubación (De la Rosa Fraile, 2011). Un cultivo puro es aquel que se obtiene de

la multiplicación de una sola bacteria; se supone que una colonia aislada proviene de una sola

bacteria; el cultivo puro se incrementa en un medio de cultivo apropiado, el cual se selecciona

según la experiencia del técnico y la información bibliográfica disponible (CIAT; 1981). Como

ya se ha mencionado, en la naturaleza las bacterias conviven con gran variedad de otros

microorganismos y solo en muy raras ocasiones se encuentran como especie única. Por ejemplo,

en las muestras clínicas usualmente las bacterias patógenas se encuentran junto con las de la flora

indígena, por lo que es necesario aislar las primeras. En muchos procesos industriales es

necesario recuperar solo el agente de interés, dentro de una flora mixta. Por estas y otras razones,

se emplean técnicas que permitan la separación de los diferentes tipos de bacterias presentes en

una muestra, así como también que permitan evaluar la pureza de un cultivo. Solo al tener la

certeza de que el cultivo está puro, es posible realizar cualquier estudio bacteriológico (Cavallini,

2016).
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2. Objetivo

2.1 Objetivos generales

2.1.1 Aplicar técnicas para el desarrollo de los medios de cultivo y la importancia de sus

componentes para crecimiento bacteriano.

2.1.2 Aplicar los métodos bacteriológicos más usuales para el crecimiento y aislamiento

de microorganismos.

2.2 Objetivos específicos

2.2.1 Preparación de medios de cultivo comerciales: Agar nutritivo, Caldo nutritivo.

2.2.2 Técnica de siembra en caldo de cultivo, Técnica de siembra en placa de Petri,

Técnica de siembra en tubo inclinado.

2.2.3 Obtención de cultivos axénicos: en superficie, en profundidad.

3. Materiales y métodos

Para la realización del laboratorio se requieren los siguientes recursos o materiales:

Medios de cultivo comerciales: Agar nutritivo, caldo de cultivo, balanza, autoclave, baño maría,

plancha de calentamiento, magneto más varilla seca magneto, guantes de tela, incubadoras, 2

cajas de Petri con agar nutritivo, 4 cajas de Petri vacías y estériles, tubos de ensayo con agar

nutritivo y enfriado a 45ºC, 5 tubos de ensayo para agar inclinado, mechero, asas con soporte

recto y de argolla, Erlenmeyer 250ml más tapón de algodón y papel aluminio, probeta 100ml,

cuchara para pesar, propipeta, 2 pipetas estériles 1ml, 2 tubos con agua peptona por 9ml, tubo
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pequeño para agar en columna para 4ml, tubos con cultivo mixto y puro, cinta vinilpel para sellar

cajas

3.1 Preparación medios de cultivos comerciales

3.1.1 Agar nutritivo

 Preparar 6 cajas Petri con siembre en superficie

 Preparar tubo en columna

 Preparar tubo inclinado

 Adicionar 140ml de agar nutritivo de acuerdo con las especificaciones del

fabricante

3.1.2 Caldo nutritivo

 Preparar 8ml haciendo el cálculo de acuerdo con las especificaciones de fabricante

3.2 Siembra en tubo

3.2.1 Siembra caldo de cultivo

 Se esteriliza el asa calentándola en el mechero hasta el rojo vivo

 Flamear la boca del tubo en que se introducirá el microorganismo

 Con el asa se siembra la muestra de microorganismos en el tubo de ensayo inclinado,

posteriormente se flamea el asa.

3.2.2 Siembra tubo agar inclinado

 Flamear boca del tubo para esterilizar

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 Con el inoculo del microorganismo realizar movimiento suave sobre la superficie del

agar en forma de zigzag, desde el fondo hasta la parte superior utilizando el asa

esterilizada

 Flamear boca del tubo, tapar y encubar

3.3 Siembra en la caja de Petri

 Flamear el borde de la caja Petri para esterilizar

 Con el inoculo del microorganismo realizar movimiento suave sobre la superficie del agar

en forma de zigzag, desde el fondo hasta la parte superior utilizando el asa esterilizada

 Flamear el borde la caja, tapar y encubar

3.4 Prueba de motilidad en agar

 Flamear boca del tubo para esterilizar

 Sembrar por picadura el microorganismo a profundidad sin tocar el fondo utilizando un

hilo y retirándolo con la misma trayectoria de la picadura

 Flamear la boca del tubo

3.5 Aislamiento por superficie

 Tomar muestra de microrganismo del tubo que contiene cultivo mixto, sembrar por estría

un tercio de la caja que contiene agar nutritivo

 Flamear asa

 En el extremo de la caja realizar rayas suaves utilizando el asa, realice estrías

 Girar la caja 90º, con el asa flameada realizar las rayas y continuar con las estrías

 Repetir las veces que sean necesarias para el aislamiento de las colonias
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3.6 Aislamiento en profundidad

 Tener medio de cultivo preparado en tubos o Erlenmeyer fundido a 45ºC

 Se agrega muestra de microorganismo para agregar a un tubo con agua peptonada para

dilución

 Se le agrega 1 mL de la dilución a sembrar en el centro de la caja de Petri estéril.

 Agregar el medio de cultivo en la caja de Petri y homogenizar por movimientos

giratorios horizontales en varias direcciones, teniendo cuidado de no formar burbujas.

 Dejar solidificar y encubar

4. Resultados

4.1 Medios de Cultivo

Figura 1. Medios de cultivos líquidos. A) Caldo lactosado. B) Caldo brilla. C) Caldo salmosyst

(Luna, 2020).
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Figura 2. Medios de cultivo sólidos. A) Agar SS. B) Agar Baird Parker. C) Agar sangre.

D)Agares LIA, TDI y citrato en forma inclinada (Luna,2020).

Figura 3. Medios de cultivo semisólidos. A) Observación de crecimiento bacteriano en todo el

medio (móvil). B) Observación de crecimiento bacteriano solo en la línea de inoculación

(inmóvil) (Luna, 2020).

4.2 Métodos de aislamiento

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Fig

ura 4. Aislamiento por diseminación en un medio sólido en placa Petri. a) Continua (Izurieta,

2011). b) Dos fases (Izurieta, 2011). c) Tres fases (Pérez Morales et, al 2017). d) Cuatro fases

(Ramírez-López et, al 2016).

Figura 5. Aislamiento en placa por dilución sucesiva. a) y b) (Izurieta, 2011).

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4.3 Métodos de siembra

Figura 6. Método de siembra en tubos. a) Siembra por estría en medio inclinado (Agar TSI, s.f).

b) Siembra por picadura (Vidal Toro, 2014). c) Siembra por picadura y estría (Vidal Toro, 2014).

5. Discusión

Los medios según su estado físico se pueden clasificar en sólidos, líquidos y semisólidos, como

se pueden observar en las figuras 1, 2 y 3. Por parte de la figura 1, se encuentran los medios

líquidos, en donde se muestran Caldo lactosado, Caldo brilla y Caldo salmosyst; el caldo

lactosado es un medio rico en nutrientes sin inhibidores de crecimiento, en este el extracto de

carne y la peptona, son la fuente de carbono y nitrógeno, mientras que la lactosa es el hidrato de

carbono (Chavaco, 2014), es incluido en muchos métodos estándar para analizar alimento,

productos lácteos y otros materiales para enterobacterias y otros microorganismo Gram-

negativos, como la salmonella (American Public Health Association, 1967). Por otra parte,
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también está el caldo brilla (caldo lactosado bilis verde brillante), es un medio liquido selectivo,

ya que selecciona a las bacterias del grupo coliforme, contiene bilis que ayuda a la inhibición de

bacterias gran-positivas y lactosa que favorece el crecimiento de poliformes (Montoya, 2008).

Por parte de la figura 2, se tienen los medios sólidos, como se puede observar está el medio de

cultivo agar SS, el cual es un medio microbiológico mixto, es selectivo debido a su contenido de

inhibidores de bacterias Gram-positivas y es diferencial ya que contiene lactosa y un indicador de

pH, este tipo de agar es recomendado para realizar el aislamiento de salmonella y shiguella

(Montoya, 2008). De la misma figura, se encuentra el Agar Baird Parker, el cual es un medio

solido moderadamente selectivo, de diferenciación para el aislamiento y de recuento de

Staphylococcus aureus en alimentos, muestras ambientales y clínicas. Este medio, contiene la

fuente de carbono y nitrógeno necesaria para el crecimiento microbiológico. Los que actúan

como agentes selectivos son la glicina, el cloruro de litio y el telurio de potasio, en cambio, el

huevo se constituye como el sustrato (BD Diagnostic Systems, 2006).

También se tiene el agar sangre, un medio de cultivo solido con sangre ovina proporcionando

crecimiento de la mayoría de las bacterias gran negativas y positivas. Este contiene peptona de

caseína y extracto de casina los cuales proporcionan los nutrientes (nitrógeno, carbono,

aminoácidos y vitaminas) (Laborclin, 2019), Por último, de la figura 2, se tienes los medios

solidos inclinados, está en agar LIA (lisina hierro) el cual contiene lisina, una pequeña cantidad

de glucosa citrato amónico férrico y tiosulfato de sodio; se utiliza para la diferenciación de

enterobacterias, especialmente de la salmonella asizonae (Forbes et al, 2009). Por último, se tiene

al agar inclinado de citrato, el cual se utiliza para diferenciar bacillos entéricos Gram-negativos

por medio de su capacidad para utilizar al citrato como la única fuente de carbono (Forbes et al,

2009).
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En la figura 3, se pueden analizar los medios semisólidos, los cuales son utilizados para la

conservación de cepas bacterianas y la observación con su respectivo registro de bacterias

móviles. Se puede observar, como en la imagen de la izquierda se encuentra un microrganismo

móvil, ya que después de su inoculación emigro de la línea de inoculación y origino turbidez

alrededor, en cambio, en la imagen derecha al ser un microorganismo inmóvil creció a lo largo de

la estría.

En la figura 4 se observa la técnica de aislamiento por estría o agotamiento en placa el cual es un

medio cualitativo de aislamiento de microorganismos por agotamiento en placa a partir de una

muestra natural o de un cultivo de laboratorio. Es un método simple u rápido de agotamiento

progresivo y continuo del inóculo sobre un medio sólido, generalmente contenido en una placa de

Petri. El objetivo es obtener a partir de un elevado número de bacterias, un número reducido de

ellas distribuidas individualmente a lo largo de la superficie de la placa. Al incubar esta, cada una

de las bacterias originará una colonia. Las colonias individuales construyen cada una un cultivo

puro (Sanz, 2011).

Por otro lado, en la figura 5 se muestra el método de aislamiento en placa por diluciones

sucesivas el cual consiste en realizar diluciones sucesivas de la muestra en condiciones de

esterilidad con objetivo de sembrar después cantidades conocidas de las mismas en una serie

paralela de placas de Petri. Claramente, alguna de las diluciones será tal que, al distribuir una

parte de ella en la placa, originará colonias separadas. Conocidos el número de colonias, la

cantidad sembrada y la dilución correspondiente, esta técnica permite también evaluar el número

de gérmenes viables en la muestra original (Sanz, 2011).

En los métodos de siembra, además de la siembra por estrías en caja Petri visto en la figura 4 y la

siembra por inmersión visto en la figura 5 también se tiene como se muestra en la figura 6 el
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método de siembra por estría en tubos con medio sólido inclinado el cual consiste en tomar el asa

previamente esterilizada y añadir al tubo desde el fondo de la superficie con movimientos en

zigzag ascendentes. Este método se utiliza para conservar cepas durante largos periodos, así

como para la realización de ciertas pruebas bioquímicas como en la prueba de ureasa. También se

observa el método de siembra por picadura el cual consiste en introducir el asa en el medio de

cultivo que se encuentra en el tubo hasta el fondo de este y en posición central. Esta técnica se

suele usar para la siembra de medios de cultivo semisólidos. Finalmente se observa la siembra

por picadura y estría la cual consiste en la utilización de las dos técnicas mencionadas

anteriormente. Primero se realiza la siembra por picadura y posteriormente la siembra por estría

(Vidal Toro, 2014).

6. Conclusión

Con la identificación y estudio de los medios de cultivo líquidos, solidos, semisólidos, métodos

de aislamiento y de siembra investigados teóricamente se logró analizar que cada método

necesariamente utilizado dependerá de las condiciones y necesidades necesarias para el

crecimiento y mantenimiento de los microorganismos que se desean estudiar debido a que estos

tienen mayor afinidad con diferentes medios y nutrientes específicos, estos medios pueden ser de

gran ayuda para obtener una conservación de las cepas bacterianas u comprobación de bacterias

móviles e inmóviles, con respecto al aislamiento por estrías o agotamiento el cual es un medio

cualitativo de aislamiento en el que se obtiene un cultivo puro, inicialmente con una gran
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cantidad de bacterias las cuales por medio de las estrías realizadas se reduce considerablemente y

se logra tener una mejor caracterización.

7. Cuestionario

1. ¿Cuál es la base fundamental o compuesto para solidificar un medio de

cultivo?

En los medios de cultivo sólidos, los microorganismos crecen sobre la superficie; esto permite la

formación de colonias aisladas, un paso fundamental para la identificación microbiana

(morfología de colonias). Al mismo tiempo, este tipo de medios permite un fácil acceso al

microorganismo para una posterior manipulación y para la conservación de un cultivo durante un

periodo de tiempo largo. Se diferencian porque tienen una sustancia de sostén, que puede ser

agar-agar. Ejemplo de compuestos: Agar Común, Agar SS, Agar Cerebro Corazón, Agar

Saboureaud, etc. (Prats, 2006)

2. Describa las condiciones de esterilización para un medio de cultivo

Los mecanismos que se usan para esterilizar medios de cultivo son:

Autoclave (calor húmedo): consiste en someter el material a una temperatura de 121ºC (1,1

atmósferas o 15 lb/in2 o p.s.i.), durante 20 minutos. Sin embargo, estos parámetros se pueden

modificar dependiendo de la composición, naturaleza del medio (densidad) o el volumen a

esterilizar, etc. La autoclave se puede utilizar para la esterilización de medios de cultivo ya sean

sólidos (agares) o líquidos, soluciones, material de vidrio, gomas o ciertos tipos de plásticos

(policarbonato o polipropileno), acero inoxidable y también material de trabajo como ropas,

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algodón, gasas, etc. También es un mecanismo que se utiliza para esterilización final de medios

de cultivo.

Tindalización (calor húmedo): El procedimiento consiste en aplicar tratamientos térmicos de 30

minutos a 100ºC durante tres días consecutivos, dejando el material a temperatura ambiente o a

37ºC en intervalos de 24 horas. Las temperaturas cercanas a los 100ºC destruyen las formas

vegetativas, pero no las endosporas bacterianas, por eso se requiere la realización de tres periodos

de tratamientos consecutivos con el fin de permitir el desarrollo de las formas esporuladas en los

intervalos a temperatura ambiente. Este procedimiento se puede utilizar en medios de cultivo con

azúcares, gelatina, sueros o huevo que se descomponen a temperaturas elevadas (Pérez-Uz et, al

2011).

3. Defina que es un medio de cultivo selectivo-diferencial. De un ejemplo

Los medios de cultivo selectivos son aquellos formulados químicamente de tal forma que

favorezcan el crecimiento de una especie la cual se desea aislar, suprimiendo a cualquier otra

especie. Además, los medios diferenciales también son aquellos que favorecen el aislamiento de

una especie partiendo de un cultivo mixto, permitiendo reconocer y detectar mediante

características bioquímicas el valor taxonómico, por ende, el medio de cultivo selectivo-

diferencia está compuesto de estas características, permitiendo seleccionar y diferenciar los

microorganismos. Como ejemplo se tiene al agar SS y agar EMB (Luna, 2020).

4. ¿Cuál es el propósito de efectuar métodos de siembra por estrías?

El propósito es separar un tipo de microorganismo a partir de una población heterogénea de

microrganismos, esto se necesita debido a que raramente se encuentra un solo tipo de

microorganismo en una muestra, por lo tanto, es necesario hacer un procedimiento de aislamiento

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que permita la separación e identificación de los distintos tipos de microorganismos presentes,

por ende, este método es importante en la obtención de las colonias bien separadas de las que se

conseguirá un cultivo puro. Una vez obtenidos los cultivos puros se podrán estudiar las

características macroscópicas, microscópicas y fisiológicas de un microorganismo en particular

(Santambrosio et al., 2009).

5. ¿Por qué razón lo medos sólidos deben ser totalmente disueltos o fundidos

antes de ser autoclavados?

El medio solido bebe estar disuelto o fundido por completo antes de llevar a la autoclave porque

el exceso de temperatura produce un medio con grumos debido a la deficiencia de disolución

(Santambrosio et al., 2009).

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Chavaco, S. (24 de agosto de 2014). Caldo lactosado. Slideshare. Recuperado de:

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